热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响

郭丽红， 李 念， 徐 亚， 曾洁媛

(1.昆明学院云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214；2.昆明学院农学院，云南 昆明 650214)

【研究意义】在自然界中各种农作物遭受各种逆境胁迫时表达一系列防御基因，产生相应的耐逆境生理、生化途径，从而获得耐逆境能力。拟南芥热激因子AtHsfA1a是与耐逆境有关的主要转录调控因子，抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)是在逆境中参与抗逆性形成的重要抗氧化酶，进一步鉴定热激因子AtHsfA1a与APX基因的关系，对于揭示热激因子AtHsfA1a生理功能的作用机制具有重要的意义。【前人研究进展】植物逆境信号转导的研究发现，转录因子在调控防御基因表达中起重要作用。植物热激因子(heat shock transcription factors，HSFs)是真核生物热激反应的主要转录调控因子[ 1-2 ]。正常生长条件下，HSF是以非活性单体的形式存在，逆境胁迫诱导HSF形成有活性的三体，而与靶基因启动子区的热激元件(heat shock element, HSE)特异性结合，以调控靶基因的转录表达，从而控制生理功能[3-5 ]。在拟南芥中存在21个热激因子的同源体，组成热激因子家族[ 4]。虽然目前对绝大多数同源体的功能还不了解，但研究显示其中热激因子AtHsfA1a是与耐逆境有关的主要转录因子[ 5-7 ]。研究也发现各种逆境胁迫均可诱发细胞内活性氧浓度的增加而导致氧化胁迫，最终导致植物死亡[ 8-10 ]。然而植物细胞中的抗氧化酶系统可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧直接或间接地清除，保障了细胞内各种生命代谢活动的正常进行[ 11-13 ]。目前关于热激因子与抗氧化酶关系的研究主要集中在抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)上，Storozhenko等研究发现热胁迫可以诱导Apx1基因表达[14 ]，Panchuk，et al.于2002年研究发现拟南芥过量表达HSF3可以使热胁迫下的抗氧化酶Apx活性高于野生型[ 15 ]，且出现新的同工酶，Apx的mRNA水平也高于野生型。研究还发现Apx的启动子包括热激因子HSF的结合位点[15 ]。然而，AtHsfA1a 对APX的影响研究不多，并且在逆境中，由于逆境信号的级联反应，很难区分HSFs直接与靶DNA结合以调控抗APX基因的表达，还是由处理逆境引起细胞产生的其它反应而导致APX基因的表达。【本研究切入点】本研究以T-DNA 插入AtHsfA1a基因突变拟南芥及野生型植株为材料，比较热胁迫下不同基因型植株的抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的变化，从生理水平揭示细胞内AtHsfA1a突变对APX活性的影响；为了研究AtHsfA1a 对APX影响的分子机制，采用RT-PCR分析热胁迫不同基因型植株APX基因的表达水平，采用染色质免疫沉淀技术和凝胶阻滞电泳研究AtHsfA1a与APX基因启动子区的体内外结合情况。【拟解决的关键问题】从生理生化和分子水平鉴定AtHsfA1a与APX的关系，为揭示热激因子AtHsfA1a在逆境中的作用机制和生理功能范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

拟南芥哥仑比亚种(Arabidopsisthaliana，ecotype Columbia)，包括野生型(简称WT)和T-DNA 插入AtHsfA1a基因突变拟南芥(SALK-068042, 购于美国生物资源中心ABRC, 简称MT )。

1.2 方法

1.2.1 材料栽培及高温处理 种子用0.1 %的HgCl2和70 %的乙醇进行灭菌处理后，接种于1/2 MS固体培养基[15]中，置于25 ℃光照下萌发。待种子长出4片真叶，把小苗移至土壤中，用保鲜膜遮盖，在生长室培养3 d后去膜，恒温培养。取生长4周的小苗进行高温处理：将洗净后的拟南芥植株置于SIB Buffer(0.5 mmol/L K2HPO4，0.5 mmol/L KH2PO4，1 % 蔗糖，pH 6.0) 中，42 ℃高温处理10 min。对照实验的处理温度为25 ℃。

1.2.2 抗坏血酸过氧化物酶活性的测定 取叶片0.5 g于预冷的研钵中，加1 mL预冷的提取液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 值 7.0，含20% 甘油，5 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA，1 mmol/L ASA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L GSH)冰浴研磨成匀浆,于4 ℃下15 000 r/min离心30 min，取上清液备用。在25 ℃水浴中预热30 min反应混合液 (50 mmol/LTris-HCl 缓冲液，pH 7.0，内含0.1 mmol/L EDTA)2.890 mL。加入10 mmol/L H2O230 μl，酶液50 μl，最后加入30 mmol/L ASA 50 μl以启动反应，终体积为3 mL。每隔10 s读出OD290的减少值来计算酶活性。

1.2.3 抗氧化酶基因的mRNA的测定 总RNA提取采用QIAGEN RNA提取试剂盒，用 1.5 %的凝胶电泳(120V)15 min，在凝胶成像仪下检测总RNA。反转录合成cDNA按照下列配方：RNA/mRNA(8 μl)、Trans criptTmRT/RI Enzyme Mix(1 μl)、Anehored Oligo(dT)18(1 μl)、2×TS Reaction Mix(10 μl)，RNase-free Water to 20 μl,轻轻混匀后,在水浴锅中42 ℃孵育30 min后，在85 ℃的水浴锅中加热5 min失活Trans ScriptTmRT。反转录产物作为PCR的模板，以APX启动子片段为引物(APX-F： 5’-CGGCGTTATTATCGTCAG-3’，APX-R：5’-AAGCAGGAGTGAGCTACAGA-3’)进行PCR扩增, 以Actin-F: 5'-TTGTCACACACAAGTGCATCAT-3'; Actin-R: 5'- AAGCTGGGGTTTTATGAATGG-3'为对照。程序如下： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃10 min，35个循环，扩增后的产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 染色质免疫沉淀技术(CHIP)分析AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合 按照Guo LH (2008)等方法[ 5 ]，将上述逆境处理后的小苗，在室温下浸入crossing buffer 中(0.4 mmol/L sucrose, 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF, 1 % formaldehyde),在真空下培养15 min后 加入终浓度为100 mmol/L甘氨酸在真空下培养5 min以终止交联反应。小苗用无菌去离子水冲洗后，按照Guo，et al.的方法，利用AtHsfA1a专一性抗体，进行免疫沉淀，所获得的沉淀DNA，用APX基因启动子区的引物进行PCR扩增，扩增后的产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 凝胶阻滞电泳(EMSA)分析AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合 凝胶阻滞电泳(EMSA)按照Guo LH (2008)等方法[ 5 ]，40 ng AtHsfA1a 与 40 fmol 生物素标记的HSE-探针在25 ℃ 共培养 20 min后用凝胶阻滞电泳分析。在竞争实验中, 加入获得的APX基因启动子区片段。以标准牛血清蛋白(BSA)作为负对照，用于AtHsfA1a结合片段的特异性研究。

2 结果与分析

2.1 热激因子AtHsfA1a突变对拟南芥幼苗在热胁迫中APX酶活性的影响

WT：野生型；MT：T-DNA插入突变型WT: Wild-type plants； MT: T-DNA inserted mutant of Arabidopsis AtHsfA1a图1 不同基因型拟南芥植株在热胁迫下APX的活性变化Fig.1 Activity of APX in different genotypes of Arabidopsis thaliana plants under heat stress

WT：野生型；MT：T-DNA插入突变型 WT: Wild-type plants;MT: T-DNA inserted mutant of Arabidopsis AtHsfA1a 图2 不同基因型拟南芥植株在热胁迫下APX的表达情况Fig.2 Expression of APX in different genotypes of Arabidopsis thaliana plants under heat stress

为了从生理水平揭示细胞内AtHsfA1a 对APX活性的影响，测定热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥和野生型植株中APX酶活性变化，结果如图1所示，在对照环境中(25 ℃)下，2种基因型植株的APX的活性差异不大，但在热胁迫42 ℃下处理10 min后，野生型植株中的活性升高较大，但AtHsfA1a基因突变拟南芥活性的变化没有野生型的明显，说明拟南芥AtHsfA1a突变对热胁迫中APX活性有影响。

2.2 热激因子AtHsfA1a突变对拟南芥幼苗在热胁迫中APX表达的影响

为了研究AtHsfA1a 对APX影响的分子机制，采用RT-PCR法比较热胁迫下不同基因型植株中APX的表达量，以肌动蛋白(Actin)为内参，从图2可知，野生型的APX基因42 ℃下的表达量高于25 ℃的表达量，且野生型的APX的表达量在2种温度下均比AtHsfA1a基因突变植株的高，说明在热胁迫下AtHsfA1a突变能够影响抗氧化酶APX基因的表达。

2.3 CHIP体内鉴定AtHsfA1a与APX的基因启动子区的结合状况

为了研究AtHsfA1a在体内的表达水平是如何影响抗氧化酶APX基因的表达，应用染色质免疫沉淀技术(Chip)体内筛选AtHsfA1a的靶DNA，以AtHsfA1a的靶DNA为模板，以APX基因启动子区域设计引物进行Promotor-specific-PCR扩增,体内鉴定AtHsfA1a与抗氧化酶的基因启动子区的结合状况，其结果如图3。

从图3可以知道，在热胁迫下，以抗氧化酶APX基因启动子区的片段为引物，野生型植株有扩增产物，而AtHsfA1a基因突变拟南芥植株无扩增条带，说明AtHsfA1a在体内能与抗氧化酶APX的基因启动子区的结合，影响抗氧化酶APX的表达。

2.4 EMSA体外鉴定AtHsfA1a与APX的基因启动子区的结合状况

T DNA：总DNA；CHIP DNA：染色质免疫沉淀DNA；WT：野生型，MT：T-DNA插入突变型T DNA：Total DNA；IP DNA：Chromatin immunoprecipitation DNA； WT: Wild-type plants, MT: T-DNA inserted mutant of Arabidopsis AtHsfA1a图3 CHIP体内验证AtHsfA1a与抗氧化酶APX的基因启动子区的体内结合状况Fig.3 The binding of AtHsfA1a to the promoter regions of APX investigated by using chromatin immunoprecipitation

HSE* ：生物素标记的标准的热激元件；BSA：标准牛血清蛋白HSE* ：Biotin labeled perfect heat shock element；BSA：Standard bovine serum albumin图4 EMSA体外验证AtHsfA1a与抗氧化酶APX的基因启动子区片段的结合状况Fig.4 The binding of AtHsfA1a to the promoter regions of APX investigated by using electrophoretic mobility shift assay

为了研究AtHsfA1a对抗氧化酶APX基因的表达影响是直接的还是间接的，设计含有热激元件(HSE)的保守片段(GAATTC)进行人工合成，生物素标记合成的DNA片段。选择染色质免疫沉淀技术(Chip)体内筛选出的能被APX启动子区引物扩增片段为竞争性片段，标准牛血清蛋白(BSA)用于AtHsfA1a结合片段的特异性进行研究。采用电泳迁移率变动分析(EMSA) 体外鉴定AtHsfA1a与APX的启动子区域的特异性片段的结合情况，结果如图4。从图4可知,在EMSA中染色质免疫沉淀技术(Chip)体内筛选出APX1基因启动子区片段能特异性地与热激元件竞争结合AtHsfA1a，体外验证了AtHsfA1a直接与APX的基因启动子区的结合，进一步说明了AtHsfA1a对APX的影响是直接的。

3 讨 论

植物对高温抵抗能力的变化与细胞生理生化的一系列适应性变化有关。热胁迫损伤细胞膜系统并导致氧化胁迫，抗氧化酶系统的增强与提高植物的抗逆性密切相关[ 8-10 ]。前期研究均表明抗氧化酶APX在逆境中可以通过活性升高或表达量的增加而提高抗逆性。拟南芥HSF是一个大的蛋白质家族，研究发现，拟南芥HSF除调控热激蛋白表达外，也可调控一些非热激蛋白的表达，例如拟南芥HSF3可以在热胁迫下可以提高抗氧化酶Apx活性，同时Apx的mRNA水平也提高[15]，研究还发现Apx的启动子包括热激因子HSF的结合位点[14]，说明拟南芥HSF家族与APX密切相关。然而，拟南芥AtHsfA1a 与APX的关系研究不多。研究者前期利用热激因子AtHsfA1a基因沉默植株研究发现AtHsfA1a对APX有影响。本研究采用T-DNA 插入AtHsfA1a基因突变拟南芥植株的目的是该植株由于T-DNA 插入导致AtHsfA1a基因的无法正常表达，研究结果表明T-DNA 插入AtHsfA1a基因突变植株的APX活性要比野生型植株中的活性弱，从生理水平说明体内AtHsfA1a与APX活性有关。关于AtHsfA1a是直接调控APX的活性，还是调控APX的表达需要进一步研究。为了从分子水平研究AtHsfA1a与APX表达的关系，本研究采用RT-PCR分析热胁迫不同基因型植株APX基因的表达水平，结果表明AtHsfA1a基因突变植株中的APX的mRNA的相对量低于野生型，说明AtHsfA1a可以诱导APX的表达。虽然目前研究显示逆境诱导热激因子调控抗氧化酶APX基因的表达；然而很难区分HSFs直接与靶DNA结合以调控抗氧化酶基因的表达，还是由处理逆境引起细胞产生的其它反应而影响APX的表达。由于染色质免疫沉淀技术可以找出在生理条件下转录因子与靶DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况，而凝胶阻滞电泳 (EMSA)又称为电泳迁移率变动分析，它是一种在体外证实目的蛋白与DNA直接结合的方法[5]。因此采用了染色质免疫沉淀技术和凝胶阻滞电泳研究AtHsfA1a与APX基因启动子区片段的结合情况，体内和体外鉴定APX是否是热激因子直接调控的下游靶基因。结果表明，在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中未筛选出APX基因启动子区片段，而野生型筛选出APX基因启动子区片段，且AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合是直接的，初步说明AtHsfA1a对APX表达的调控是直接的。

4 结 论

热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥APX的影响是从转录调控水平直接影响APX的表达，这将为揭示热激因子AtHsfA1a在逆境中的作用机制和生理功能范围提供理论依据。

[1]Wunderlich M, Doll J, Busch W, et al. Heat shock factors: regulators of early and late functions in plant stress response[J].Plant Stress, 2007(1):16-22.

[2]Akerfelt M, Morimoto R I, Sistonen L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan[J].Molecular Cell Biology, 2010,11:545-555.

[3]von Koskull-Döring P, Scharf K, Nover L. The diversity of plant heat stress transcription factors[J]. Trends Plant Sci, 2007, 12: 452-457.

[4]Nover L. Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need?[J]. Cell Stress Chaperones, 2001(6):177-189.

[5]Guo LH, Chen S N, Liu KH, et al. Isolation of heat shock factor HsfA1a-binding sites in vivo revealed variations of heat shock elements in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Physiol, 2008, 49:1306-1315.

[6]Liu Y, Zhang C, Chen J, et al. Arabidopsis heat shock factor HsfA1a directly senses heat stress, pH changes, and hydrogen peroxide via the engagement of redox state[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2013, 64: 92-98.

[7]Liu H, Liao H, Charng Y. The role of class A1 heat shock factors (HSFA1s) in response to heat and other stresses inArabidopsis[J]. Plant Cell Environ, 2011, 34:738-751.

[8]Imlay J A. Pathway of oxidative damage[J]. Annu Rev Microbiol, 2003,57:395-418.

[9]Mittler H. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in Plant Science, 2004(9): 490-498.

[10]Foyer C H, Noctor G. Oxidant and antioxidant signaling in plants: a reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context[J]. Plant Cell Environ, 2005, 28:1056-1071.

[11]Busch W, Wunderlich M, Schöffl F. Identification of novel heat shock factor-dependent genes and biochemical pathways inArabidopsisthaliana[J]. The Plant Journal, 2005, 41:1-14.

[12]Davletova S, Rizhsky L, Liang H,et al. Cytosolic ascorbate peroxidase 1 is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2005, 17: 268-281.

[13]周 静，曾学英，贺 维，等.低温胁迫下蓝花楹的耐寒生理机制分析[J].西南农业学报,2016,29:74-80.

[14]Storozhenko S. The heat-shock element is a functional component of the Arabidopsis APX.I gene promoter[J].Plant Physiol, 2005,118: 1005-1014.

[15]Panchuk I I, Volkov R A, Schoffl F. Heat stress and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2002, 29: 838-853.