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氟苯尼考浸泡栉孔扇贝后各组织中含量的测定❋

2018-02-28周飞飞李志林苏荣国石晓勇韩秀荣

关键词:氟苯尼扇贝蓄积

周飞飞, 李志林, 苏荣国❋❋, 石晓勇, 韩秀荣

(1.中国海洋大学化学化工学院,山东 青岛 266100; 2.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 266100; 3.国家海洋局海洋减灾中心, 北京 100194)

氟苯尼考(Florfenicol)又名氟甲砜霉素,其化学名称为D (+)-苏-1-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇,是一种新型的氯霉素类广谱抗菌药[1-2]。该抗生素药具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广、安全高效等特点,对敏感菌所致的畜禽细菌性疾病治疗效果显著,特别是毒副作用显著降低[3]。因此, 氟苯尼考自1990年代引进以来广泛用于水产 、禽类等动物的细菌性疾病防治。

近年来随着食品安全问题日益突出,对以氟苯尼考为代表的抗生素类药物的研究受到越来越多的重视,研究氟苯尼考在水生生物体内代谢消除规律,评估其在生物体内的蓄积及毒性,对水产养殖业科学施药具有重要的指导意义。目前国内外对于氟苯尼考研究主要集中在鱼类、蟹类、虾类等动物[4-6],对于扇贝的研究未见正式报道。栉孔扇贝(Chlamysfarreri,)是北方沿海地区主要的海水养殖贝类之一,由于其营养丰富,经济价值高,成为我国重要的渔业资源之一。本文以栉孔扇贝为对象,研究其不同组织对氟苯尼考的蓄积与消除规律,以期在栉孔扇贝养殖中合理施用氟苯尼考提供参考。

1 材料与方法

1.1 栉孔扇贝

栉孔扇贝由青岛沙子口养殖场提供,平均壳长(6.0±0.5)cm,在玻璃培养箱进行暂养,时间为7天。所使用海水的pH在8左右,温度25 ℃左右,盐度为32。暂养期间每天定时换清洁海水1次,并且定时投饵,死亡率低于5%后方可进行实验。

1.2 实验药品与试剂

氟苯尼考标准品(纯度>98%,北京百灵威科技有限公司)、氟苯尼考粉(上海华南动物药品有限公司)、乙腈(色谱纯,德国Merck Drugs & Biotechnology),己烷、甲醇、乙酸乙酯、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均由上海国药有限公司提供的分析纯试剂,海水采自青岛市沙子口附近海域。

1.3 仪器与设备

高效液相色谱仪(Agela, LC-10F)、高速离心机(德国,sigma)、高速冷冻干燥机(美国金西盟国际集团)、超声清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)、C18-SPE柱(迪马科技)、氮气吹干仪(上海旌派仪器有限公司)、电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)

1.4 实验方法

1.4.1 急性毒性实验

预实验 先将氟苯尼考原粉按10、100、1 000和5 000 mg·L-1的剂量配制溶液,设置3个对照组,每组放置10只栉孔扇贝,根据24 h的死亡率估计半致死浓度可能范围。试验期间不进行投喂。

正式实验 用少量分析纯甲醇将氟苯尼考原粉溶解配制成母液。由于预实验中100 mg·L-1溶液中栉孔扇贝的24 h死亡率为0,5 000 mg·L-1的24 h死亡率为100%,所以在这两者的浓度范围内设置浓度梯度。用海水稀释母液配成6个浓度梯度组,分别为0、300、600、1 200、2 400和4 800 mg·L-1,经液相色谱测得5个浓度梯度有效含量为0、61.8、123.9、247.0、494.4和988.8 mg·L-1(分析方法见1.4.5,后面涉及的浓度均为有效浓度),每组设置3个平行组,每组放置10只栉孔扇贝。分别记录每天的死亡个数(玻璃棒轻触无反应即可定为死亡)。连续观测96 h,期间不进行投食,用SPSS11.5对急性毒性数据进行线性回归法分析[7-8],计算出半致死浓度LC50以及安全浓度和区间估值。

1.4.2 氟苯尼考在栉孔扇贝体内蓄积实验 将栉孔扇贝分别暴露于氟苯尼考安全浓度以上(A组,40 mg·L-1)、安全浓度水平(B组,20 mg·L-1(见2.1部分))和安全浓度以下(C组,10 mg·L-1)的海水中,每个浓度设置3个平行对照组,每组放置50只栉孔扇贝,培养条件与暂养条件保持一致,每24h换一次水。分别在1、2、4、6、8天的20:00在每个培养箱内随机选取2只栉孔扇贝进行解剖实验,取出栉孔扇贝的闭壳肌、外套膜、内脏团,-20℃冷冻保存。

生物对污染物的蓄积能力通常用生物蓄积系数[9],即BCF(Bioconcentration factors)表示,BCF值越大,生物对该污染物的蓄积能力越强,BCF按下式计算。

式中:Ck和Cw分别为污染物在生物体内和水体中的含量(mg·kg-1)。

1.4.3 氟苯尼考在栉孔扇贝体内的消除实验 蓄积实验第9天,从上述培养箱中分别取出15只栉孔扇贝,放置于洁净海水中进行培养,培养条件与暂养条件保持一致,分别于9、10、11、13和15天的20:00在每个培养箱中分别取出栉孔扇贝进行解剖实验,之后在-20℃下冷冻。

1.4.4 样品处理

步骤1 将冷冻的样品放于冷冻干燥机内冻干48h,在天平上称量,记录干重,并将样品研磨至粉末状。

步骤2 准确称取0.20 g的样品,加入5 mL的乙酸乙酯,震荡10 min之后,超声25 min,以10 000 r·min-1离心10 min,取上清液,再以3mL的乙酸乙酯重复提取,合并2次的上清液。

步骤3 置于40 ℃氮吹仪上吹干,加入8 mL的磷酸盐缓冲液(K2HPO4-KH2P04,pH=6.0),震荡溶解20 min。加入2×5 mL正己烷振动去脂,以6 000 r·min-1的转速离心10 min后,弃去上清液[10-11]。

步骤4 将提取液以不超过2 mL·min-1的速度通过SPE柱,减压抽干5 min,以6 mL甲醇洗脱,洗脱液于40 ℃下氮吹至干,以流动相定容1 mL。溶液经0.45 μm滤膜过滤后,待测[12]。

1.4.5 液相色谱分析方法 色谱柱:Agilent PLRP-S 100A C18(5μm 150 mm×4.6 mm);流动相:v乙睛∶v水=1∶3;流速:1.0 mL·min-1;波长:225nm; 柱温:35 ℃,进样量:25 μL。

1.4.6 标准曲线绘制和回收率计算 标准储备液及工作液的配制:分别准确称取0.010 0 g氟苯尼考标准品于1L容量瓶中,用20%乙睛水溶液溶解并定容至刻度,配制成10 mg/L的标准储备液,于0℃条件下保存。使用时用20%乙睛水稀释,配制成不同剂量浓度的溶液,浓度分别为1、0.5、0.1、0.05和0.01 mg·L-1。在HPLC上测定出各个剂量浓度对应的峰面积,以氟苯尼考峰面积为纵坐标, 剂量浓度为横坐标绘制标准工作曲线, 求出回归方程和相关系数。

在不含氟苯尼考的栉孔扇贝的外套膜、内脏团、闭壳肌中分别添加10.00、2.00和0.50 mg的氟苯尼考标准品,配制3份平行样。24 h后按1.4.4中第1~4步骤处理样品,测定并计算回收率。

2 实验结果与分析

2.1 96 h LC50以及安全浓度

栉孔扇贝在给药后的试验过程中,出现运动频率低,行动迟缓临床症状,严重的会出现开口不闭合,对外界刺激逐渐无反应直至死亡。96 h栉孔扇贝的死亡率与氟苯尼考浓度对数的线性回归方程为:y=0.606 2x-1.306 2(y为96 h栉孔扇贝的死亡率,x为氟苯尼考浓度对数)R2=0.982 4,表明栉孔扇贝的96 h的死亡率和氟苯尼考浓度对数具有较好的相关性。

经SPSS11.5计算得氟苯尼考对栉孔扇贝的96 h LC50=213.1 mg·L-1,95%置信度区间为127.4~284.6 mg·L-1,根据表1的鱼药毒性分类标准[13],可知氟苯尼考对栉孔扇贝的毒性为中等毒性。利用公式 SC=96h LC50×0.1[14]计算得到安全浓度为21.31 mg·L-1。

氟苯尼考对不同水生生物之间的毒性存在较大的差异,其中,徐力文等[15]报道氟苯尼考对杂色鲍(Haliotisdiversicolor)的96h LC50为163 mg·L-1,与本文得到的氟苯尼考对栉孔扇贝的毒性相仿。Williams等[16]研究发现南美白对虾(PenaeusvannameiBoone)幼体经氟苯尼考溶液24 h浸泡24 h LC50为64 mg·L-1,表现出了较大的毒性。而迟吉祥等[17]测得氟苯尼考对四角蛤蜊稚贝(Mactraveneriformis)的96 h LC50为948.64 mg·L-1,对蓝鳃太阳鱼(Lepomismacrochirus)和虹蹲(Oncorhynchusmykiss)96h LC50分别大于830和780 mg·L-1[18],则表现出了较低毒性。

表1 鱼药分类等级Table 1 The classification of toxicity of fish medicine

2.2 标准品的色谱信息、标准曲线及回收率、精密度

氟苯尼考含量测定使用高效液相色谱仪,图1为加标栉孔扇贝样品中氟苯尼考高效液相色谱图。由图1可见,氟苯尼考保留时间为10.297 min,谱峰前后样品基体干扰较少。

图1 加标栉孔扇贝外套膜样品中氟苯尼考色谱图Fig.1 The spectrogram of the mantle of Chlamys farreri which was added to standard substance of florfenicol

氟苯尼考的标准曲线的线性回归方程为Y=46 404X(Y-归一化峰面积,X-氟苯尼考浓度),拟合度为R2=0.999 2,线性范围为0.01~10 mg·kg-1。各个组织的回收率为82.0%~104.3%,RSD(Relative standard deviation)范围为1.6%~9.3%,标准偏差均小于10%,表明本测定方法重复性良好,符合低浓度检测方法重现性的要求。以信噪比(S/N)为3作为确定方法定量检出限标准,测得本方法对氟苯尼考的检出限为7.0 μg·kg-1,因此该方法能够满足水产品中氟苯尼考残留量的准确测定。

2.3 栉孔扇贝各组织对氟苯尼考的蓄积

A、B、C三组栉孔扇贝的外套膜、内脏团、闭壳肌对组织内氟苯尼考蓄积情况分别如图2、3、4所示,表3为蓄积阶段各组织、各组的最大BCF值。

如图2所示,累积过程中,A组、B组和C组栉孔扇贝外套膜中氟苯尼考含量均在第1天迅速上升,分别达到5.57×10-4、3.93×10-4和1.18×10-4g·kg-1。在随后的3天内外套膜内氟苯尼考的含量逐步下降。在第4天后氟苯尼考含量又呈现出上升的趋势,并于第8天蓄积结束的时候达到峰值,此时外套膜内的氟苯尼考含量达到蓄积的最大值,分别为6.68×10-4、4.01×10-4和2.15×10-4g·kg-1。由图2与表3可知,3组外套膜中生物蓄积系数BCF均在第8天达到最大值,且其值均小于0.01,表明栉孔扇贝外套膜对氟苯尼考的蓄积能力较小,且随着水体氟苯尼考浓度增加,BCF减小,如C组的BCF最大值分别是B组和A组最大值的1.07倍和1.29倍。

表2 氟苯尼考测定的回收率和精密度Table 2 The results of recovery and precision of determination of florfenicol

Note:①Supplementation levels;②Mantle;③Visceral mass;④Adductor muscle;⑤Percent recovery

图2 不同氟苯尼考浓度下栉孔扇贝外套膜的蓄积曲线

图3 不同氟苯尼考浓度下栉孔扇贝内脏团的蓄积曲线

图4 不同氟苯尼考浓度下栉孔扇贝闭壳肌的蓄积曲线

生物蓄积系数①A组②B组③C组④外套膜⑤0.01670.02000.0215内脏团⑥0.02140.02930.0429闭壳肌⑦0.00620.00760.0115

Note:①Bioconcentration factors;②Group A;③Group B;④Group C;⑤Mantle;⑥Visceral mass;⑦Adductor muscle

从图3可以看出,内脏团中氟苯尼考含量第1天快速上升,A、B、C组分别达到8.55×10-4、5.86×10-4和2.60×10-4g·kg-1,在第2~4天期间氟苯尼考含量逐步下降,从第5天开始氟苯尼考含量又呈现上升趋势,到第8天达到峰值,3组氟苯尼考浓度分别为6.68×10-4、5.59×10-4和4.29×10-4g·kg-1。各组内脏团的BCF值最大值分别在第1、1和8天取得,同样也是C组的BCF值最大,分别是B组的1.46倍和A组的2.00倍。

由图4可知,闭壳肌中氟苯尼考含量变化趋势与外套膜和内脏团相同,同样在第1天达到一个峰值,A、B、C组氟苯尼考浓度分别为2.49×10-4、1.53×10-4和1.15×10-4g·kg-1。其后,A组在第2~4天期间逐步下降,于第4天后开始逐渐升高;B、C两组在第2~5天期间氟苯尼考含量逐渐下降,第6天起重新出现升高趋势,3组均于蓄积过程最后一天也就是第8天达到峰值,3组氟苯尼考浓度分别为1.53×10-4、0.68×10-4和0.31×10-4g·kg-1。A、B、C组第1天的BCF达到最大,此时C组的BCF值同样明显高于A组和B组,为A组的1.85倍和B组的1.5倍。

而将富集过程中A组、B组和C组栉孔扇贝同一组织(外套膜、内脏团和闭壳肌)中氟苯尼考含量分别进行方差分析,结果显示在95%的置信水平下3组之间均存在显著性差异(P<0.01),表明环境中氟苯尼考含量对其在各组织中的吸收有较大的影响。总体而言,蓄积过程中随着海水中氟苯尼考浓度升高,栉孔扇贝各组织中的氟苯尼考含量也相应的增大,但BCF值却随之而下降。任加云等[19]在研究栉孔扇贝中的石油烃蓄积规律时发现,石油烃浓度越高,BCF越小,与本实验的结果一致。这表明低浓度条件下,栉孔扇贝更容易对氟苯尼考产生蓄积作用。各组织BCF值均很低,说明栉孔扇贝对氟苯尼考的蓄积能力较差。余培建等[20]和岳刚毅等[21]在欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)等水生生物体内氟苯尼考代谢规律研究中发现,氟苯尼考在生物体内的蓄积速度和蓄积量均很低,与本实验所得的结果一致。

氟苯尼考在栉孔扇贝各组织中蓄积随时间的变化趋势具有相似性,这种变化趋势与刘丽娟等在研究扑草净在菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的蓄积规律时的发现一致,均表现为:第一阶段氟苯尼考含量先较快升至最高值,随后迅速降低;第二阶段降低到一定浓度水平后再次上升至一个高点[22]。出现第一阶段变化趋势的可能原因:一是水中颗粒态氟苯尼考是栉孔扇贝主要的摄食对象,起始阶段,栉孔扇贝摄食了大量的氟苯尼考颗粒而导致内脏团中氟苯尼考的含量在第1天迅速升高,随着食物的消化排出和由水中氟苯尼考含量降低而导致的栉孔扇贝对氟苯尼考颗粒摄入减少,使得内脏团中氟苯尼考在2~3天时快速下降。对于外套膜而言,带有氟苯尼考颗粒的海水通过外套膜间的空隙进入体内,由于通道狭小故水流减缓,较大较重的颗粒由于重力作用掉落到外套膜上。同时,到达鳃的表面的颗粒经鳃丝过滤并运送至狭小的食物运送沟,在此,较大较重的颗粒也从沟中脱落掉到外套膜上,虽然外套膜上的纤毛会将脱落的颗粒运送到壳口排出,但外套膜上终会有一部分颗粒,导致实验前期外套膜的蓄积出现相同的变化。闭壳肌只是关闭贝壳的作用,不参与摄食与消化,但前期摄入大量的氟苯尼考颗粒会导致血液中的浓度升高,从而引起闭壳肌中的高峰,但升高的程度比直接参与摄食的器官要低很多。二是起始阶段,栉孔扇贝各组织逐渐吸收氟苯尼考,随着暴露时间增加,栉孔扇贝体内开始适应并触发了对氟苯尼考的代谢,其代谢速率随着体内氟苯尼考的含量升高而提高且代谢速率升高具有滞后性,在蓄积开始阶段短时间内氟苯尼考的蓄积效应大于代谢效应,表现为蓄积第1天氟苯尼考含量的总体增加。而随着体内氟苯尼考含量的升高,代谢速率也不断提高,使得代谢速率高于蓄积速率,氟苯尼考含量在2~3天内开始下降。出现第二阶段变化趋势的原因可能为:栉孔扇贝对氟苯尼考的代谢速率也随着氟苯尼考含量的下降而逐渐降低,在低于其蓄积速率时又表现为氟苯尼考含量的升高,而且此时栉孔扇贝出现部分中毒症状,代谢速率进一步降低,因此出现蓄积后期4~8天氟苯尼考含量升高的情况。

而对于栉孔扇贝不同组织的蓄积规律,在蓄积阶段,将A组、B组和C组栉孔扇贝各组织BCF值进行方差分析,结果显示在95%的置信水平下外套膜、内脏团和闭壳肌BCF值之间存在显著性差异(P<0.01),表明各组织对氟苯尼考的蓄积能力不同。内脏团中氟苯尼考含量明显高于外套膜与闭壳肌,此后,栉孔扇贝各组织中氟苯尼考含量顺序一直为:内脏团>外套膜>闭壳肌,这表明氟苯尼考的主要蓄积部位在内脏团,而闭壳肌的蓄积相对较小。这一结果与氨基脲等在栉孔扇贝中的蓄积规律一致[23], 出现这样情况的原因可能为内脏团作为栉孔扇贝体内的解毒组织,会对大部分的氟苯尼考进行截留蓄积,但内脏团不能对较高浓度的氟苯尼考进行全部截留,会有部分随血液循环被其它部位蓄积。因此内脏团由于截留作用而使其蓄积能力最强,而闭壳肌也由于内脏团的的部分截留作用使其含量始终在3个组织中最小,因此食用闭壳肌比食用整体贝肉更安全。

2.4 栉孔扇贝各组织对氟苯尼考的消除

A、B、C 3组栉孔扇贝的外套膜、内脏团、闭壳肌对组织内氟苯尼考清除情况分别如图5、6、7所示,表4为消除阶段栉孔扇贝中各个组织、各浓度组的日均消除速率。

图5 不同氟苯尼考浓度下栉孔扇贝外套膜的消除曲线

图6 不同氟苯尼考浓度下栉孔扇贝内脏团的消除曲线

图7 不同氟苯尼考浓度下栉孔扇贝闭壳肌的消除曲线

日均消除速率①/10-4g·kg-1·d-1A组②B组③C组④外套膜⑤1.300.7800.254内脏团⑥1.230.9660.586闭壳肌⑦0.2190.1250.037

Note:①Daily elimination rate;②Group A;③Group B;④Group C;⑤Mantle;⑥Visceral mass;⑦Adductor muscle

由图5可知,消除过程中,在栉孔扇贝外套膜中,A、B组氟苯尼考含量第1天开始较快下降,随后,在第2~5天时氟苯尼考含量下降速度逐渐放缓,在第5天时含量维持在较低水平,接近为0。而C组栉孔扇贝的外套膜中氟苯尼考含量在1~2天下降速度缓慢,从第3天开始下降速度加快,到第7天时,氟苯尼考含量接近为0。从表4可以看出,A组中外套膜对氟苯尼考日均消除速率最大,其次为B组,最后为C组。

从图6可以看出,在清除过程中,A组扇贝内脏团中氟苯尼考含量下降,在第5天时含量接近为0;B组扇贝内脏团氟苯尼考含量在1~2天内下降,从第3天下降速度开始减小,在第5天时氟苯尼考含量接近为0;C组内脏团中氟苯尼考含量在第1~3天期间平稳下降,在第3天以后下降速度减小,在第7天时氟苯尼考含量接近为0。

据图7可知,与外套膜、内脏团一样,在消除阶段,A、B、C组闭壳肌氟苯尼考含量缓慢下降,3组闭壳肌中氟苯尼考含量分别在第5、5、7天降至最低值,接近为0。

对消除过程中A、B和C组栉孔扇贝同一组织中氟苯尼考含量分别进行方差分析,结果显示在95%的置信水平下各组均存在显著性差异(P<0.01),表明消除起始时体内氟苯尼考含量对消除过程各组织中的消除速率有较大的影响。由表4可知,在消除阶段栉孔扇贝3个组织对氟苯尼考的日均消除速率大小顺序为:A组>B组>C组。栉孔扇贝各组织对氟苯尼考的日均消除速率大小顺序为:内脏团>外套膜>闭壳肌,原因可能是内脏团是栉孔扇贝的解毒组织,对氟苯尼考的分解消除速率最快;而外套膜由于消除过程中和洁净的海水直接接触,物质交换较快,因此消除的平均速率也相应较快;闭壳肌中氟苯尼考含量本身较低,且与外界环境接触较少,消除速率较慢。

闭壳肌作为栉孔扇贝的主要食用部位,该部位在蓄积与消除过程中的氟苯尼考含量都是3个组织中最小的,在同一时间段时内脏团和外套膜中氟苯尼考含量大约是闭壳肌的2~7倍。因此栉孔扇贝对氟苯尼考的蓄积主要集中在内脏团与外套膜中,但同时闭壳肌对氟苯尼考的消除能力是最小的,因此在氟苯尼考污染较为严重的海域内,必须经过一段时间的清除净化才能出售采集的栉孔扇贝。各国对水产品中氟苯尼考(胺)最大残留限量的规定略有不同,中国规定鱼类带皮肉为1 mg·kg-1;欧洲规定为有鳍鱼类带皮肌肉1 mg·kg-1,每日允许摄入量(ADI)为3 μg·kg-1(体重);加拿大规定鲑科鱼类肌肉中0.8 mg·kg-1;美国食品药物管理局规定的每日摄入量为10 μg·kg-1;对此要求最为严格的日本在《食品中残留农业化学品肯定列表制度》中规定氟苯尼考在部分水产品MRL为0.1 mg·kg-1[12,24-25]。本文研究结果表明,在消除过程进行1天后,闭壳肌中氟苯尼考含量最大不超过0.1 mg·kg-1,可以满足上述各国家对氟苯尼考残留的要求,因此,对栉孔扇贝使用不超过200 mg·kg-1的氟苯尼考进行药浴后,在清水中清除24 h以上即可安全食用,选用的氟苯尼考浓度越高,停药后所需要的清除时间越长。

3 结论

(1)经氟苯尼考栉孔扇贝急性毒性实验可得,氟苯尼考对栉孔扇贝的96 h半致死浓度LC50为213.1 mg/L,安全浓度为21.31 mg/L,符合鱼药分类等级中度毒性标准。

(2)蓄积过程中,栉孔扇贝各组织(外套膜、内脏团、闭壳肌)对氟苯尼考蓄积浓度随水体浓度增大而增大,而生物蓄积系数BCF随着海水中氟苯尼考含量升高而下降;消除过程中,栉孔扇贝各组织对氟苯尼考的日均消除速率大小顺序为:安全浓度以上组>安全浓度水平组>安全浓度以下组。

(3)蓄积过程中,栉孔扇贝各组织中氟苯尼考蓄积量大小顺序为:内脏团>外套膜>闭壳肌;消除阶段时,栉孔扇贝各组织对氟苯尼考的日均消除速率大小顺序为:内脏团>外套膜>闭壳肌。

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