姜黄素调控自噬抑制K562细胞增殖的体外研究

于波海，于 鑫，王 鑫，滕 旭

(1.哈尔滨医科大学 生物学博士后流动站，黑龙江 哈尔滨150081；2.哈尔滨市第一医院 检验科，黑龙江 哈尔滨150010；3.大连大学附属中山医院 医学检验部，辽宁 大连116001；4.银川市兴庆区掌政镇中心卫生院，宁夏 银川750001)

姜黄素 (Curcumin) 是从姜科姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种相对分子质量小的多酚类物质,通常认为它是姜黄中的最有效成分[1]。研究显示，姜黄素可抑制肺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤等多种肿瘤细胞增殖[2]。姜黄素作为天然化合物，在抗肿瘤作用中具备多个靶向通路，同时能够规避常规抗肿瘤药物的抵抗性，因此姜黄素在抗肿瘤方面应用前景广泛。自噬 (autophagy) 是细胞防御和应激调控的重要机制，在抗肿瘤、抵抗微生物、代谢平衡等方面发挥重要的生物学作用[3]。慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞是CML研究中重要的实验模型，该细胞可产生BCR-ABL融合蛋白，可评估多种细胞或分子反应，如：细胞死亡模式(自噬或凋亡) 、肿瘤细胞分化以及BCR-ABL酪氨酸激酶降解等。本研究以K562细胞为研究对象，观察姜黄素对K562细胞增殖以及自噬作用的影响，并探讨可能的机制。

1 实验材料与方法

1.1 细胞株

慢性粒细胞白血病急变细胞系K562购自和元生物技术(上海)股份有限公司。

1.2 主要试剂

RPMI 1640 培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自以色列Biological Industries公司(Cat No.04-001-1A；Lot No.215356) ；青、链霉素抗菌液，购自美国GIBCO公司；3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA) 购自Sigma-Aldrich公司；姜黄素购自Sigma-Aldrich公司；四唑氮蓝(MTT) 购自Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠LC3 IgG购自日本MBL公司；鼠抗人β-actin IgG购自中杉金桥公司。

Western Blotting ECM增强显色法检测试剂盒(Cat No.EK1004) 购自武汉博士德生物工程有限公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Cat No.AR0138) 购自武汉博士德生物工程有限公司。蛋白质定量试剂盒(Cat No.5000002) 购自美国Bio-Rad公司。其它试剂均为国产分析纯。

1.3 主要试剂配制

姜黄素用DMSO完全溶解，配制成100 mM储存液，4℃保存备用。

1.4 主要仪器

酶标仪(美国 Bio-Rad 公司) ；MCO-17A1型二氧化碳培养箱(日本Sanyo公司) ；ClassII typeA2生物安全柜(北京东联公司) ；垂直电泳槽、转移电泳槽(美国 Bio-Rad 公司) ；FACS Calibur流式细胞仪(美国 BD公司)。

1.5 MTT检测K562细胞增殖

实验分为对照组和药物处理组，取对数生长期K562，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于96孔板中，经姜黄素与3-MA作用6,12,24 h后，培养终止前4 h弃培养上清，加入100 μl MTT (5 mg/ml) 溶液，实验终浓度分别为1.00，2.50，5.00，10.00，20.00 μM/L，每一浓度设3个平行孔，对照组加终浓度为0.04% DMSO， CO2孵箱内培养，离心(1 000 r/min,5 min),然后弃去孔内培养液，每孔加人100 μl DMSO，震荡180秒后，用 酶标仪于570 nm波长处测定其吸光度A值，重复3次，按下列公式计算细胞抑制率 (Inhibition Rate,IR) :抑制率= (A对照组值-A实验组值)/(A对照组值-A空白对照值)×100%。

1.6 细胞蛋白提取与Western blot分析

收集约3×106个K562细胞，加入预冷的裂解缓冲液 (含1% Triton X-100，1%脱氧胆酸和0.1% SDS) 冰上裂解30 min。蛋白浓度采用Bradford加以测定 (Bio-Rad，CA，USA) 。获取50 μg蛋白在12%浓度的分离胶中进行SDS-PAGE，电泳结束后将其转印至硝酸纤维素膜上，并用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，最后分别加入相应一抗以及二抗，化学发光、显影 (Amersham Bioscience，NJ，USA) 。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期K562细胞接种于6孔培养板中(5×105/孔)，对照组加入终体积分数为 0.04%的 DMSO及3-MA(2 μmol/L)，药物处理组分别加入终浓度为20.00 μM/L的姜黄素和3-MA，培养48 h后收集细胞，用预冷的PBS 洗涤细胞一次，1 500 rpm，5 min离心收集，调整细胞浓度为 1×106/mL，取1 ml单细胞悬液。70%预冷乙醇 500 μl固定过夜，检测前去除固定液，加入碘化丙啶(PI)，于 4 ℃避光处理30 min，上机检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素抑制K562细胞增殖

姜黄素 1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μM浓度作用于K562 细胞12、24、48小时，结果显示，姜黄素对K562细胞株的增殖存在明显抑制作用 (P<0.05) ，且存在剂量依赖关系(图1)。

图1 不同浓度姜黄素在不同时间点对K562细胞增殖抑制作用

2.2 自噬抑制剂3-MA降低姜黄素对K562细胞的抑制作用

MTT结果显示，应用20.00μM浓度的姜黄素作用K562细胞24 h后，其增殖作用受到明显抑制；而单独应用3-MA (2 μmol/L) 作用于K562细胞24 h，K562细胞增殖无明显影响；与单独使用姜黄素相比，姜黄素与3-MA联合应用于K562细胞，其增殖的抑制作用明显下降 (P<0.05) ，由此可见， 3-MA可以有效降低姜黄素对K562细胞的增殖抑制作用(图2)。

图2 姜黄素与自噬抑制剂3-MA对K562细胞增殖抑制作用

2.3 姜黄素增强LC3-II表达

Western blot结果显示，应用20.00 μM浓度姜黄素作用K562细胞24 h后LC3-II表达增强，LC3-II/LC3-I比值增加；姜黄素与3-MA(2 μmol/L) 联合应用于K562细胞，LC3-II表达减弱，LC3-II/LC3-I比值下降 (图3)。

图3 不同浓度姜黄素对K562细胞LC3- II / LC3- I表达的影响

2.4 姜黄素对K562细胞周期的影响

应用20.00 μM浓度姜黄素作用K562细胞48小时后，流式细胞仪检测结果显示，G1 期细胞增加,G2 期细胞数明显减少，S期细胞也明显减少，与对照组相比较差异显著(P<0.05)。姜黄素与3-MA联合应用于K562，与G1周期停滞比率明显下降，S期细胞明显增多，与姜黄素组相比较差异显著(P<0.05) (图4)。

图4 姜黄素对K562细胞周期的影响

2.5 姜黄素诱导P53、P21、P27蛋白的表达

Western blot结果显示，应用应用20.00 μM浓度姜黄素作用K562细胞24 h后，p53、p21及p27蛋白表达水平随着姜黄素浓度的增加而增高，加入3-MA后，姜黄素对p53、p21及p27的诱导作用明显减弱(图5)。

3 讨论

慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML) 是一类起源于多功能造血干细胞的恶性克隆性疾病。其诊断特征是9号染色体平衡易位至22号染色体，形成t (9;22) (q34;q11.2 )，即费城染色体(Philadelphia chromosome,Ph1)形成及BCR-ABL融合基因的产生[4]。尽管格列卫作为靶向药物已经应用于临床多年，但耐药现象的发生严重干扰临床治疗效果并危及患者的生命，故继续研究开发治疗CML新药物，探索新的治疗策略一直受到国内外学者的关注。

图5 姜黄素P53、P21、P27蛋白表达影响

细胞自噬是由基因调控高度保守的自行降解过程，在抵御外来刺激、自我净化、内环境稳定、代谢平衡、抵抗微生物及治疗肿瘤等方面发挥重要的生物学作用。研究表明，姜黄素作用于人类结肠癌 HCT116细胞，诱导ROS产生，促进LC3I向LC3II转化，激活细胞自噬[5]。四氢姜黄素(Tetrahydrocurcumin) 是姜黄素主要的代谢产物，作用于人类白血病 HL-60 细胞，通过下调PI3K/AKT-mTOR及MAPK信号通路，诱导自噬[6]。

实验中将姜黄素与K562细胞株孵育，通过MTT实验检测细胞增殖。结果显示，姜黄素能够抑制K562细胞增殖，并存在剂量、时间依赖关系。我们进一步研究了姜黄素是否通过自噬途径影响K562细胞的增殖， 我们使用了3-甲基腺嘌呤(3-MA)，目前常用的一种自噬抑制剂，主要通过抑制哺乳动物细胞中的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)来抑制自噬的起始阶段。与姜黄素单独应用相比，姜黄素与3-MA联合应用后，对K562细胞增殖抑制作用明显下降，从而发现姜黄素抑制K562细胞增殖与自噬相关。

为了明确姜黄素作用K562细胞诱导自噬现象的发生，我们应用WB实验检测LC3表达水平。LC3是使用最广的自噬标志物，定位于自噬泡上。自噬形成时，LC3- I (胞浆型LC3) 会酶解掉一小段多肽，转变为LC3- II ( 膜型结合型LC3) 。LC3- II / LC3- I比值的大小可评估自噬水平的高低。结果显示，姜黄素作用K562细胞显著上调LC3- II / LC3- I比值，从而证实姜黄素诱导K562细胞自噬现象的发生。

K562细胞为高S期细胞，S期细胞增多提示DNA 复制活跃，处于增殖期的细胞增加，同时，从G1期向S期转换的周期检测点(check point)功能减弱，使发生突变的细胞可以不受周期检测点的调控，直接进入S期复制，导致癌变的发生。姜黄素在调控K562细胞周期中发挥的一定的作用，细胞周期阻滞于G1期，进入S期的细胞大量减少，抑制细胞增殖，加强了机体内的DNA修复系统，增加DNA的修复，减低白细胞突变的发生率。而联合应用3-MA后，G1周期停滞比例明显减少，可见姜黄素诱导K562细胞周期停滞作用于自噬相关。

我们考虑到细胞程序性死亡包含细胞凋亡和自噬两个过程，二者即联系又区别[7]。自噬调控网络非常复杂，P53作为自噬调节的关键分子，通过转录激活P21、生长抑制及DNA损伤诱导基因45alpha (Growth arrest and DNA damage-inducible gene45 alpha,Gadd45α) 及Bax等诱导细胞周期停滞、凋亡或自噬以及衰老抑制细胞增殖[8]。P53诱导自噬机制尚不明确，研究认为活化的 P53 会抑制自噬负调节子- 哺乳动物雷帕霉素靶点 (mammalian target of rapamycin,mTOR) ，形成自噬体以及 LC3的酯化和剪切引起自噬。P53可以通过转录依赖方式：AMP激活蛋白激酶活化抑制mTOR；和转录非依赖方式：上调mTOR抑制剂第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)及结节性硬化症相关复合物1(Tuberous sclerosis complex 1,TSC1) 诱发自噬[9]。随后检测了p53、p21和p27的表达水平。结果显示，姜黄素有效上调p53、p21和p27的表达，加入3-MA抑制自噬后，姜黄素对p53、p21和p27的上调效应减弱。以上结果证实，姜黄素抑制K562细胞增殖、诱导细胞周期停滞与自噬有关，这与国外研究结果一致。

综上所述，本研究实验证实了姜黄素诱导K562细胞发生自噬影响细胞增殖及细胞周期，增强p53、p21及P27自噬调节相关蛋白活性等一系列活动，从而发挥抑制肿瘤作用。在随后的工作中，我们将对PI3K/AKT-mTOR信号通路及mTOR下游分子开展深入探讨，以进一步明确自噬抑制K562细胞增殖的分子机制。

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