实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

苗文静　安玉志　孙文文

[摘要] 目的 采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT）在临床淋球菌检测中的应用。 方法 以淋球菌培养法为标准对照，采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测，对结果进行统计学分析比较，并用PCR法进行验证。 结果 使用SAT检测的生殖道拭子和尿液陽性检出均为110例，培养法阳性检出为108例，其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义（P>0.05）;以培养法为金标准，SAT 检测拭子的敏感度为100.0%，特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%，特异度为 95.2%。 结论 采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比，阳性率高，敏感度较高，且尿道标本收集方法比较简便，患者依从性好，可代替拭子道取样方法，此方法可在临床推广应用。

[关键词] 淋球菌;荧光核酸恒温扩增技术;尿液

[中图分类号] R446          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2018）34-0120-04

荧光核酸恒温扩增检测技术（simultaneous amplification and testing，SAT）是新型核酸（RNA）检测技术，它把核酸恒温扩增技术和实时荧光检测相结合，采用磁珠法特异性提取目标RNA，为提高提取效率，采用高速离心、高温加热技术，并且目标 RNA 提取过程中不易降解，交叉污染几率变小[1-2]，与传统方法相比，降低污染引起的假阳性几率。这项技术也被应用于结核杆菌、沙眼衣原体、解脲脲原体等多种疾病的诊断[3-5]。

本文采用SAT技术同时对疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测，对结果进行统计学分析，与传统的淋球菌培养法进行比较，并采用临床常用的PCR法验证，然后以培养法作为金标准，比较敏感度和特异度，评价其在临床上应用的可行性。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

淋球菌分离培养基购自珠海银科医学工程公司。PCR试剂盒由深圳匹基生物工程有限公司提供，SAT法恒温扩增检测试剂盒（NG-SAT）由上海仁度生物提供。生物安全柜（Thermo Fisher1300）;全自动核酸提取仪（AB Mag MAXTM Express 96）;高压灭菌锅（厦门致微GR85DR）;生化培养箱（广东环凯SP250）;Light Cycler 480实时荧光定量 PCR 仪（Roche 公司）。

1.2 样本来源

来本院就诊的疑似病例150例，其中男80例，女70例，年龄28～65岁。患者均由主治医师检查，并询问其生活状况确定为疑似病例。样品采集均用编号以保证病人隐私，患者涉及到不同地区、患病或不患病人群，具有地区与人群代表性，并征求患者同意。对每例患者分别采集3份生殖道拭子标本和1份尿液标本。

1.3 样本采集方法

1.3.1 生殖道拭子标本采集  男性患者用无菌盐水冲洗尿道口多次，在尿道1～2 cm处;女性患者清除阴道宫颈口的分泌物后，在宫颈口2～3 cm处插入无菌棉拭子采集样本，注意抽出拭子时要避免与阴道壁接触，然后置无菌试管内快速送检接种。要求所有患者在采集标本前1周均不能使用抗生素治疗。第1支拭子用于淋球菌培养;第2支拭子用0.9%生理盐水1.5 mL洗脱，取1 mL洗脱液至专用尿液保存液中（试剂盒提供），混匀后，-20℃冰箱保存，备用于 SAT 检测;第3支拭子用0.9%生理盐水1 mL洗脱，-20℃冰箱保存，备用于PCR检测。

1.3.2 尿液标本采集  初段尿1 mL与1 mL尿液保存液（SAT试剂盒提供）混合置于EP管中，在-20℃冷冻储存，备用于SAT检测。

1.4 检测方法

1.4.1 淋球菌培养法  生殖道拭子标本采集后立即送检，1 h内接种，严格遵照试剂说明书进行操作及结果判定。

1.4.2 SAT检测  将备用保存的拭子洗脱液从冰箱取出平衡至室温，操作严格按照试剂盒说明书要求进行，将400 μL含有尿样保存液的尿液样本与100 μL核酸提取液均匀混合，在60℃恒温 5 min后，室温放置 10 min，转移至半自动核酸提取仪上进行分离提取，核酸 RNA 提取完成以后，定量吸取 30 μL含磁珠的扩增检测液至微量反应管，预热后加酶，在同一温度下（42℃），用RNA作为起始模板，通过 M-MLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用 T7-RNA多聚酶从该DNA拷贝产生出100～1000个RNA拷贝;每个RNA 拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环带，最后转至 Light Cycler 480荧光定量PCR仪中启动反应程序。反应程序：荧光标记选择羧基荧光素，42℃保持1 min，共40个循环;每分钟收集1次荧光信号，共检测 40 次，记录数据。

1.4.3 PCR法检测  将备用保存的拭子洗脱液从冰箱取出平衡至室温，严格遵照试剂说明书按照操作及结果判定进行检测。

1.5 判定标准

以淋球菌培养法为金标准，评价SAT 法的灵敏度、特异性。根据方法确认性能指标要求[6]：灵敏度≥98%，特异性≥90.4%进行判定，见表1。

1.6 统计学分析

使用SPSS19.0统计学软件分析数据，计数资料以例数或百分率表示，并进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAT法检测结果

采用SAT法检测，150例疑似患者中，生殖道拭子标本检出阳性110例，尿液标本检出阳性110例，淋球菌培养法检出108例，其中2例用SAT 法检测均为阳性，而淋球菌培养法检测为阴性，用PCR法进行验证后为阳性。符合率100%。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义（P> 0.05）。见表2。

2.2 SAT检测灵敏度和特异度计算

根据1.5项下统计方法，对检验数据进行整理统计得出SAT法与国标法阴阳性结果，统计结果见表3。同时使用淋球菌培养和 NG-SAT 检测150 例，以淋球菌培养法为金标准，SAT检测生殖道拭子灵敏度为 100.0%，特异度为95.2%;SAT 检测尿液灵敏度为 100.0%，特异度为95.2%。

3 讨论

淋病的病原体是奈瑟氏淋球菌，唯一宿主是人类[7]。淋病的临床表现多见于尿道炎及宫颈炎，典型的症状为：尿频、尿急、尿痛、排尿困难及排出黏液或脓性分泌物等。此外病菌还可能侵犯到眼睛、咽部、直肠以及盆腔等处，通过血液播散感染进而引发关节炎、脑膜炎、败血症等疾病。在全国流行病学调查中发现，其在性病病种构成比中占比较大，所占排名比较靠前[8]。淋球菌感染所致的淋病在我国是发病率较高的性传播疾病，并每年呈上升的趋势，2018年仅4月份全国报告淋病达1万多例[9]，已经严重威胁到人民群众的身心健康，成为重要的公共卫生问题[10]。

淋球菌作为人体的寄生菌多存在于人体的阴道炎和急性尿道炎的脓性分泌物中，是造成尿道炎和阴道炎的常见菌，所以准确、快速的检测出淋球菌对早期诊断淋球菌性尿道炎和阴道炎具有重要的临床应用价值[11]。目前临床上淋球菌的检测方法有3种：淋球菌培养法、PCR检测法和新型的SAT检测法。传统检测方法在敏感性和特异性上都有各自的不足之处。淋球菌培养法敏感性稍差，而PCR法的敏感性较高，对采集标本的要求也没有那么严格，但是PCR不能区分出病原体是死菌还是活菌，不适合用于判愈，因为患者经临床治疗后病菌死亡或者症状消失即判为治愈，如果要等PCR法检测为阴性，体内死菌全部排完，势必造成过度治疗[12，13]，另外，生殖道拭子标本中DNA消失的时间为6～9 d[14]，临床已治愈的患者此期内PCR检测仍可出现假阳性。本文对新型的SAT检测进行研究，得到的结论具有临床意义。

本文采用的实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT），检测研究表明，相同患者的生殖道拭子标本和尿液标本同时利用SAT检测，结果与淋球菌培养法结果完全一致，并通过PCR法验证，表明使用SAT检测法检测尿液标本可以代替检测生殖道拭子标本，这样可以提高对侵入取样敏感人群的依从性，能够增加一些携带者被及时诊断及时治疗的机会，相应减少潜在传染的几率。虽然尿液标本中的杂菌数量很高或者血尿和蛋白尿时会引起假阳性[15]，但是应用SAT法可以帮助而且快速辨别假阳性避免漏检，对于疑似病例的早期诊断具有重要临床意义[16]。以淋球菌培养法为金标准，SAT 检测生殖道拭子敏感性为 100.0%，特异性为95.2%;SAT 检测尿液标本敏感性为100.0%，特异性为95.2%，数据结果表明敏感性和特异性均较高且一致。在150例疑似病例标本中有2例同一患者生殖道拭子和尿液标本SAT检测均为阳性，而淋球菌培养为阴性，这2例标本经PCR检测法验证后为阳性，这可能是因为淋球菌培养耗时长，容易造成尿道感染的女性患者漏检[17，18]，可能是因为淋球菌培养法敏感性不高所致，也说明SAT 检测法的高灵敏性。

本研究结果显示SAT法检测疑似淋球菌感染患者尿液标本具有较高的灵敏度和特异度，SAT法表现出耗时短、低污染、结果准确性高等优点，而且可以直接用尿液代替生殖器拭子取样，无侵入感，更为患者所接受，是一种非常值得在临床上推广应用的检测方法。

[参考文献]

[1] 苏敬泽，汤全贵.拭子培养、尿沉渣培养和聚合酶链反应-杂交梳检测淋球菌[J].中华皮肤科杂志，2001，43（2）：178-180.

[2] Lawe P. Camparison of the gen-probe Aptma CAMBO assay to the AMPLICOR CT/NG assay for detection of chlamydia tra-chamatis and Neissetria gonorrhoeae in urine samples from Aust-talian men and women[J]. J Clin Microbio，2006，44（18）：2619-2621.

[3] 许光辉，赵柳婵，陈华.实时荧光核酸恒温扩增技术在肺结核诊断中的价值分析[J].临床肺科杂志，2015，20（8）：1487-1489.

[4] 顾伟鸣，杨阳，吴磊.实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染[J].临床检验杂志，2010， 28（4）：271-272.

[5] Unoki M，Kumamoto K，Takenoshita S，et al. Reviewing the current classification of inhibitor of growth family proteins[J]. Cancer Sci，2009，100（7）：1173-1179.

[6] 李宏，雷质文. 食品微生物检测方法确认和证实手册[M].北京：中国标准出版社，2013：5-90.

[7] 劉勇波，陈燕如.200株淋球菌耐药检测结果分析[J].现代医院，2016，16（6）：854-857.

[8] 秦倩倩，朱昊，张丽芬，等.2003年全国行性病流行病学分析[J].疾病监测，2004，19（10）：381-383.

[9] 叶顺章.性传播疾病的实验室诊断[M].北京：科学出版社，2001：73-81.

[10] 中国疾病预防控制中心.2018年4月全国艾滋病性病疫情[J].中国艾滋病性病，2018，24（6）：535.

[11] 彭碧华，黄海花，梁佩婵，等.纸片扩散法常规检测淋球菌药敏试验可靠性研究[J].实用预防医学，2011，18（7）：1353-1355.

[12] 叶顺章，王千秋，王荷英，等.PCR检验技术在性病临床标本实验诊断中应用价值的研究[J].中国皮肤性病学杂志，2002，16（1）：6-8.

[13] 黄培忠，马超，黄静.淋病奈瑟菌3种检测方法结果分析[J].检验医学与临床，2009，6（20）：1750-1751.

[14] 包根书，史大中，陈根.汉防己甲素联合阿苯达唑抑制小鼠棘球蚴生长作用及其机制的研究[J].地方病通报，2003，18（4）：20-23.

[15] 张睿，叶阿里，孔令君，等.临床患者三种性传播疾病分子生物学检测分析[J].现代检验医学杂志，2015，30（3）：107-110.

[16] 张宏萍，包杰.实时荧光核酸恒温扩增技术和尿液快速检测法对孕前优生健康检查人群中淋球菌检测的应用比较[J].数理医药学杂志，2018，31（6）：907-909.

[17] Peeling RW，Toye B，Jessamine P，et al.Poling of urine speci-mens for PCR testing：acost saving strategy for Chlamydia tracho-matis control programmes[J].Sex Transm Inf，1998，74（1）：66-70.

[18] 徐杰伟，何艳嫦.三种方法检测淋病奈瑟菌的结果分析[J].国际检验医学杂志，2011，32（12）：1301-1303.

（收稿日期：2018-09-05）