ALK4对心肌梗死后心肌纤维化的影响和作用机制

陈一和 林慧 逯朝阳 相银 刘俊

[摘要] 目的 研究ALK4在心梗后心肌纤维化中的作用及分子机制。 方法 利用ALK4+/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠构建心梗模型，通过天狼星红染色检测纤维化，用WB、Real-time PCR、免疫组化技术检测梗死边缘区α-SMA、collagen1a-1、CTGF的表达，探讨ALK4在心梗后心肌纤维化中的作用。分离及培养原代ALK4+/-小鼠心脏成纤维细胞，在低氧刺激下（1% O2）研究ALK4对心脏成纤维细胞增殖、分化和分泌合成功能的影响。 结果 心梗后第28天，梗死边缘区ALK4蛋白表达水平升高，ALK4敲除后则显著少其表达。与野生型同窝对照小鼠（WT）相比，ALK4+/-小鼠梗死后生存率提高[ALK+/-（77.1）% vs WT（54.3）%，P<0.05]，心脏功能改善[LVEF：ALK+/-（48.5±3.5）% vs WT（29.3±3.8）%，P<0.05;FS：ALK+/-（24.5±2.2）% vs WT（13.9±1.9）%，P<0.05]，梗死边缘区心肌纤维化减少[ALK+/-（32.1±2.0）% vs WT（22.5±2.2）%，P<0.05]。细胞实验中，ALK4敲除则显著抑制低氧刺激下心脏成纤维细胞增殖[ALK4+/-（2.68±0.23） vs W（1.86±0.42），P<0.05]、分化[ALK4+/-（2.72±0.21） vs WT（1.43±0.31），P<0.05]和分泌合成[ALK4+/-（9.87±0.74） vs WT（4.13±1.31），P<0.05]。ALK4+/-敲除抑制低氧下Smad3的磷酸化水平[ALK4+/-（1.64±0.17） vs WT（2.79±0.32），P<0.05]而不影響Smad4表达量。 结论 ALK4表达抑制可显著抑制心梗后心肌纤维化，改善心室功能和生存率以及钝化心脏成纤维细胞对低氧刺激的反应，其作用主要通过抑制Smad3/4信号通路。

[关键词] ALK4;心肌梗死;心肌纤维化;心脏成纤维细胞

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2018）36-0029-05

[Abstract] Objective To study the role and molecular mechanism of ALK4 in myocardial fibrosis after myocardial infarction. Methods The MIK4+/- mice and wild-type C57BL/6 mice were used to construct the myocardial infarction model. Fibrosis was detected by Sirius red staining. WB， Real-time PCR and immunohistochemical techniques were used to detect the expression of α-SMA， collagen1a-1 and CTGF in the infarct edge zone. The role of ALK4 in myocardial fibrosis after myocardial infarction was explored. Primary ALK4+/- mouse cardiac fibroblasts were isolated and cultured， and the effects of ALK4 on proliferation， differentiation and secretion of cardiac fibroblasts were studied under hypoxia（1% O2）. Results On the 28th day after myocardial infarction， the expression level of ALK4 protein in the infarct border area was increased， and the expression was significantly less after ALK4 knockout. Compared with that of the wild-type littermate control mice （WT）， the post-infarction survival rate （ALK+/- （77.1）% vs. WT （54.3）%， P<0.05） and cardiac function （LVEF：ALK+/-（48.5±3.5）% vs WT （29.3±3.8）%， P<0.05; FS： ALK+/- （24.5±2.2）% vs WT （13.9±1.9）%， P<0.05） was improved， and myocardial fibrosis was reduced in the infarct border zone （ALK+/- （32.1±2.0）% vs WT （22.5±2.2）%， P<0.05） in ALK4+/- mice. In cell experiments， ALK4 knockout significantly inhibited cardiac fibroblast proliferation under hypoxic stimulation （ALK4+/- （2.68±0.23） vs WT （1.86±0.42）， P<0.05）， differentiation（ALK4+/- （2.72± 0.21） vs WT （1.43±0.31）， P<0.05） and secretory synthesis （ALK4+/- （9.87±0.74） vs WT （4.13±1.31）， P<0.05）. ALK4+/- knockdown inhibited the phosphorylation of Smad3 under hypoxia（ALK4+/- （1.64±0.17） vs WT （2.79±0.32）， P<0.05） without affecting the amount of Smad4 expression. Conclusion The inhibition of ALK4 expression can significantly inhibit myocardial fibrosis after myocardial infarction， improve ventricular function and survival rate， and inactivate the response of cardiac fibroblasts to hypoxia stimulation， mainly through inhibition of Smad3/4 signaling pathway.

[Key words] ALK4; Myocardial infarction; Myocardial fibrosis; Cardiac fibroblast

心肌纤维化是心梗后心脏结构重构过程中至关重要的病理性改变，尽管在梗死早期可有效防止心脏破裂，但是过度纤维化降低心脏顺应性，损害收缩舒张功能，影响血流动力学，导致心力衰竭、恶性室性心律失常的发生[1-3]。因此，针对心梗后心脏纤维性重构进行有效的干预是临床研究和治疗的关键。

活化素受体样激酶4（activin receptor-like kinase 4，ALK4）是位于细胞膜上的一类Ⅰ型活化素受体，隶属TGF-β受体超家族，在组织中广泛表达，是参与调控机体生理及病理过程的关键因子。ALK4的功能涉及胚胎发育、神经系统分化、生殖细胞发育、肿瘤形成及免疫抑制等[4-6]。其作用主要通过磷酸化Smad2/3信号通路分子C端的丝氨酸残基，除外Smad2/3信号通路还可通过MAPKs、Akt/PI3K、Wnt/β-catenin等，从而调控相关基因的表达[4]。Takagi等[7]发现ALK4在系统性硬化病患者的皮肤组织中表达升高，与皮肤纤维化密切相关。但ALK4在心梗后心脏重构，尤其是心肌纖维化中的作用尚不明确。因此我们将从组织水平和细胞水平两个层面对ALK4在心梗后心肌纤维化中的分子细胞机制进行详尽的研究，为临床治疗提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

ALK4+/-小鼠，小动物气体麻醉机，小动物呼吸机，天狼星红染液，TAKARA逆转录试剂盒，CCK-8试剂盒，ALK4抗体（abcam公司），p-Smad3抗体（abcam公司），Smad4抗体（abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验时间  选择2017年1月～2018年6月，在体动物实验时间均为心梗模型构建后第28天进行心超检测，心脏取材、后续分子生物学检测。离体细胞实验均采用低氧1%连续刺激24 h候后进行划痕试验、CCK-8及分子生物学检测。

1.2.2 心梗模型构建  选取10～12周龄，体重在22～25 g之间的ALK4+/-小鼠和野生型同窝对照小鼠构建心梗模型。用2%异氟烷将小鼠麻醉，固定于鼠板，行气管插管并连接气体麻醉机和小动物呼吸机。对左侧胸前区进行备皮，钝性分离、暴露第四肋间隙并开胸，用6-0的带线缝合针在左心耳下方2 mm处结扎前降支，至心肌组织明显发白以确保心梗。术毕逐层关闭胸腔，缝合皮肤。术后皮下注射青霉素80万U预防感染，每日观察小鼠的生存状况，心梗后28 d对心功能、病理组织学及分子生物机制进行检测。

1.2.3 心功能检测  心梗后第28天对各组小鼠进行心脏B超检测，用2%异氟烷麻醉小鼠，备皮后仰卧于超声工作台并固定，采用小动物超声诊断仪，频率为15 MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，分别测量左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、左室缩短分数（FS）和左室射血分数（EF）。

1.2.4 心脏组织病理学检测  心梗后28 d，将心脏取出，4%多聚甲醛固定48 h，修剪包埋。将心脏组织浸于梯度酒精脱水后在二甲苯中进行透明。随后进行透蜡，包埋，切片（厚度约为5 μm）。脱蜡水化后进行天狼星红，流水冲洗后，中性树脂封片。心脏组织切片进行collagen Ia1的免疫组化时，除上述步骤外，还需高温抗原修复，collagen Ia1一抗孵育过夜。翌日，洗片后二抗孵育，DAB显色并在显微镜下观察，并计算梗死边缘区collagen Ia1阳性染色的面积。

1.2.5 Real-time PCR检测  取心肌组织，加入Trizol试剂进行充分研磨、匀浆。加酚、氯仿提取上清液并用异丙醇沉淀RNA，酒精洗涤、晾干后溶解于DEPC水，测RNA浓度。使用TAKARA逆转录试剂盒合成cDNA，加入CTGF的引物和SYBR荧光染料，以GAPDH为内参，采用ABI 7500 Fast（Applied Biosystems）检测其CT值并计算该目的基因的相对表达量（2-ΔΔCT）。

1.2.6 Western blot检测  取心肌组织，加入蛋白裂解液（RIPA+PMSF），充分研磨、匀浆。将组织液置于冰上静置30 min后，离心取上清液。采用BCA法测定样品的蛋白浓度，加热使蛋白变性。随后分别配置分离胶和浓缩胶，在样孔内加入蛋白样品进行电泳。之后将蛋白从胶中转移到PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗孵育过夜。翌日，洗膜，室温下二抗孵育1 h。打开显影仪和软件，待机器预冷。配置ECL发光液（A液和B液比例为1∶1），加至PVDF膜上后进行显影。采集的图像使用IPP软件分析。

1.2.7 心脏成纤维细胞分离  取1～2 d 的ALK4+/-和野生型C57BL-6乳小鼠，置于75%乙醇消毒并处死。用眼科剪剪取心脏，去除结缔组织、心房、肺等组织，将心肌组织剪碎至1 mm3大小，加入0.25%胰酶，37%磁转消化，分离细胞。离心后将沉淀的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基吹打均匀，种于6 cm细胞培养皿中，差速贴壁1 h，得到心肌成纤维细胞。原代心脏成纤维细胞传至2～4代时用于后续实验。

1.2.8 CCK8检测  将分离、培养至第2～4代的心脏成纤维细胞用0.5%胰酶消化1～2 min后，用含10%FBS培养基中和，离心后弃去上清，培养基重悬。计数2 000个细胞种于96孔板中过夜。翌日，用无血清培养基饥饿12 h，更换含10% FBS培养基并置于1%的低氧培养箱中持续培养24 h。弃去培养基，配制含CCK-8的培养基（比例为1∶10），96孔板中各孔加入100 μL。37℃，5% CO2细胞培养箱中孵育2 h。在酶标仪上设置检测波长为450 nm，测定吸光度。

1.2.9 划痕试验  将分离、培养至第2～4代的心脏成纤维细胞种于6孔板中，每孔约5×105细胞量直至70%～80%的密度。用无菌的200 μL枪头在各孔中划一笔直的划痕。PBS洗涤3次，每次3 min。洗去因划痕而死亡脱落的细胞。显微镜下拍照，以显示最初始的两侧心脏成纤维细胞间的距离。随后加入不含血清的培养基，37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，拍摄各组细胞之间的迁移情况。

1.3 统计学方法

所有数据应用SPSS20.0软件进行统计学分析。生存率的比较采用Log-rank （Mantel-Cox）检验方法。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALK4敲除改善心梗后死亡率和心功能

心梗后梗死边缘区ALK4表达增加，ALK4敲除显著抑制心梗后ALK4蛋白表达（P<0.05）。心梗后28 d，与野生型同窝对照小鼠相比，ALK4+/-小鼠生存率升高[ALK+/-（77.1）% vs WT（54.3）%，P<0.05]。心脏超声结果显示ALK4+/-小鼠的LVEF和FS较野生型小鼠均明显改善[LVEF：ALK+/-（48.5±3.5）% vs WT（29.3±3.8）%，P<0.05;FS：ALK+/-（24.5±2.2）% vs WT（13.9±1.9）%，P<0.05]。

2.2 ALK4敲除减少心肌纤维化和心肌组织间细胞外基质沉积

心梗后28 d，ALK4敲除后梗死边缘区心肌间质纤维化改善[ALK+/-（32.1±2.0）% vs WT（22.5±2.2）%， P<0.05]。Real-time PCR结果显示ALK4敲除显著减少梗死边缘区collagen Ia1的表达[ALK+/-（4.28±0.65） vs WT（1.33±0.21），P<0.05]。

2.3 ALK4敲除抑制低氧刺激下成纤维细胞增殖、分化和分泌功能

与野生型心脏成纤维细胞相比，低氧刺激24 h ALK4+/-心脏成纤维细胞PCNA表达减弱，提示增殖能力下降[ALK4+/-（2.68±0.23） vs WT（1.86±0.42），P<0.05]。ALK4敲除抑制低氧诱导的α-SMA表达[ALK4+/-（2.72±0.21） vs WT（1.43±0.31），P<0.05]。同时，ALK4敲除还抑制低氧刺激下心脏成纤维细胞collagen Ia1表达合成[ALK4+/-（9.87±0.74） vs WT（4.13±1.31），P<0.05]。

2.4 ALK4通过Smad3/4信号通路调控心脏成纤维细胞功能

低氧刺激促进心脏成纤维细胞Smad3的磷酸化，而不影响Smad4蛋白表达，与野生型心脏成纤维细胞相比，ALK4+/-心脏成纤维细胞磷酸化Smad3表达量下降[ALK4+/-（1.64±0.17） vs WT（2.79±0.32），P<0.05]而Smad4蛋白表达量无变化。

3 讨论

心肌纤维化是心血管各类病因（高血压、高血糖、高血脂、柯萨奇病毒及抗肿瘤药物等）导致心脏损伤后病理表现，在心血管疾病的发生发展中起着至关重要的作用[1，2]。心梗后心肌细胞坏死凋亡，心脏成纤维细胞替代、修复以维持心脏完整的结构，防止心脏破裂[8]。然而病理刺激过度的纤维化则影响心脏收缩舒张功能。心肌纤维化的分子机制十分复杂，已知炎症反应、氧化应激、交感神经功能亢进、RAAS系统激活以及细胞因子均参与调控这一过程[9]。

TGF-β信号通路是介导心脏重构的重要信号通路，抑制TGF-β/ALK5通路活性可以显著改善大鼠心梗后收缩功能失代偿和左心室重构[10，11]。同时，研究证实除TGF-β之外的其他TGF-β超家族成员如Activin A、GDF-15、ALK2和ALK7亦参与这一结构重构的过程[12]。Activin A刺激促进乳鼠心肌细胞大量表达MMP-9、TIMP-1和TGF-β1，与心肌组织纤维化密切相关[12]。Kempf等发现急性心梗患者缺血区心肌细胞GDF-15前肽的表达升高，通过对小鼠GDF-15基因敲减后发现梗死范围增大，心肌细胞凋亡增加，从而确证GDF-15在缺血再灌注损伤中对心脏的保护作用[13]。Shahid等[14]发现心脏条件性敲除ALK2可以逆转血管紧张素Ⅱ刺激下的心脏不良重构，恢复心脏功能。Huang等[15]证实ALK7表达的抑制加重了心肌肥厚，心肌间质和血管周围纤维化，恶化心脏功能，而过表达ALK7则发挥相反的作用。上述研究结果表明除广泛研究的TGF-β/ALK5信号通路，其他TGF-β超家族的配体和（或）受体同样涉及心脏结构重构的过程。

ALK4是位于细胞膜上的一类Ⅰ型TGF-β受体，既往研究发现其主要参与胚胎发育、肿瘤发生发展，毛发生发及免疫过程[4，5，16，19，20]。在心脏组织发育形成中，ALK4是促进胚胎细胞向心肌细胞分化的关键因子，揭示其在心血管领域的重要性[6]。近年来对ALK4研究的深入发现系统性硬化患者的皮肤组织中ALK4表达升高，同时下游的Smad2/3信号通路激活[7]。系统性硬化病又称为硬皮病，是一种以局限性或弥漫性皮肤纤维化为特征的全身性自身免疫病。病变特点主要为皮肤纤维增生，最终导致皮肤硬化、血管缺血。但是到目前为止，ALK4在心梗后心肌纤维化中的作用和机制尚未阐明。课题组通过比较ALK4小鼠和野生型小鼠心梗后心功能、心肌纤维化程度的差异以明确ALK4在心梗后心肌纤维性重构中的作用。我们首次发现心梗后第28天，ALK4敲除小鼠心肌纤维化程度減弱，心肌组织中细胞外基质沉积减少，心功能明显改善。由此我们推断ALK4参与小鼠心梗模型下心脏结构重构，并与心梗后心肌纤维化密切相关。而细胞实验的结果证实ALK4敲除后的心脏保护作用主要依赖于抑制心脏成纤维细胞的激活（增殖、分化、迁移和分泌合成功能下降）。在分子机制上，ALK4在心肌纤维化中的一系列作用主要是通过激活经典的Smad3/4信号通路。Smads信号分子是参与纤维性疾病重要的通路，而Smad2/3/4是目前已知的介导ALK4作用的主要信号通路[17]。既往研究证实Smad3敲除小鼠对心梗后局部的炎症反应无明显影响，主要是减少梗死边缘区的心肌纤维化同时抑制远隔区域的反应性的纤维化从而改善心脏功能。体外实验同样显示Smad3磷酸化与心脏成纤维细胞分化、增殖密不可分，此外Smad3还可介导TGF-β对成纤维细胞的激活，促使成纤维细胞功能增强[18]。因此揭示了ALK4-Smad3/4信号通路对心梗后心肌纤维化的影响。

此外，本研究结果仍需要进一步使用对ALK4具有高度选择性的抑制剂，从外源性抑制其表达和（或）功能來验证，同时也可为临床药物应用提供新的选择。既往报道和我们的繁殖记录均显示ALK4小鼠纯合致死，所以研究均使用ALK4+/-小鼠完成，对ALK4表达抑制的程度并不彻底。同时根据研究结果显示ALK4表达升高主要在于心脏成纤维细胞，提示我们想要更深入阐明ALK4在心梗后心肌纤维化中的作用，进一步验证我们现有的结果和完善证据，需要构建成纤维细胞特异性的ALK4敲除小鼠。

因此本实验研究证实 ALK4通过调控心脏成纤维细胞增殖、分化、迁移以及分泌合成的功能介导心梗后心肌纤维化的过程，其作用机制主要通过Smad3/4信号通路介导，其功能的明确将为临床治疗提供新的可靠的干预靶点。

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（收稿日期：2018-06-14）