免疫性血小板减少症患者调节性B细胞数量及功能研究

张燕 寿黎红

[摘要] 目的 研究免疫性血小板減少症患者的调节性B细胞的数量和功能，为临床医师评估该类疾病患者的病情提供重要指导。 方法 以2016年10月～2018年7月本院接诊的初诊免疫性血小板减少症患者40例为A组，另以本院同期接诊的完全缓解免疫性血小板减少症患者35例为B组，同时将同期接诊的健康体检者40名作为对照组，设为C组。采取流式细胞术对各组的外周血Bregs数量和白细胞介素-10表达量进行检测，同时对其检测结果作出分析和比较。 结果 A组的外周血Bregs数量为（3.08±0.66）%，比B组以及C组的（5.45±0.82）%、（7.82±1.03）%低，组间差异有统计学意义（P<0.05）。A组外周血Bregs中的白细胞介素-10细胞比例为（32.29±8.68）%，比B组及C组的（51.03±10.54）%、（71.88±12.28）%低，组间差异有统计学意义（P<0.05），并且B组外周血Bregs中的白细胞介素-10细胞比例比C组低，组间差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 免疫性血小板减少症的发生与Bregs有着较为密切的关系，因此，临床医师可以将Bregs作为免疫性血小板减少症的一个重要治疗靶点，以进一步提高患者病情控制的效果。

[关键词] 白细胞介素-10;外周血Bregs数量;免疫性血小板减少症;调节性B细胞

[中图分类号] R558.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2018）36-0025-04

[Abstract] Objective To study the number and function of regulatory B cells in patients with immune thrombocytopenia， and to provide important guidance for clinicians to assess the condition of patients with such diseases. Methods A total of 40 patients with newly diagnosed immune thrombocytopenia who were admitted in our hospital from October 2016 to July 2018 were enrolled in the group A， and 35 patients with complete remission of immune thrombocytopenia who were admitted in the hospital at the same time were set as group B. 40 healthy subjects who were admitted at the same time were set as the control group（group C）. Flow cytometry was used to detect the number of peripheral blood Bregs and interleukin-10 expression in each group， and the results were analyzed and compared. Results The number of peripheral blood Bregs in group A was（3.08±0.66）%， which was lower than（5.45±0.82）% and（7.82±1.03）% in group B and group C. There was significant difference among the three groups（P<0.05）. The proportion of interleukin-10 cells in peripheral blood Bregs of group A was（32.29±8.68）%， which was significantly lower than（51.03±10.54）% and（71.88±12.28）% of group B and group C， with statistically significant difference（P<0.05）. And the proportion of interleukin-10 cells in peripheral blood Bregs of group B was lower than that of group C， and the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The occurrence of immune thrombocytopenia is closely related to Bregs. Therefore， clinicians can use Bregs as an important therapeutic target for immune thrombocytopenia to further improve the patient's disease control.

[Key words] Interleukin-10; Number of peripheral blood Bregs; Immune thrombocytopenia; Regulatory B cells

免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia，ITP）是一种获得性自身免疫性出血性疾病，约占出血性疾病总数的1/3，成人发病率约为（5～10）/10万，育龄期女性发病率高于男性，60岁以上老年人是该病的高发群体。临床以皮肤黏膜出血为主，严重者可有内脏出血，甚至颅内出血，出血风险随年龄而增加。部分患者仅有血小板减少，没有出血症状。目前已知的该病主要发病机制有：①体液和细胞免疫介导的血小板过度破坏;②体液和细胞免疫介导的巨核细胞数量和质量异常，血小板生成不足。因此，免疫性血小板减少症是一种血小板减少性疾病[1]，可对患者的身体健康造成比较大的影响。而已知B细胞的主要功能是介导体液免疫，因此常被认为是免疫应答的正向促进因素。直到1974年有学者发现将去除B细胞的脾细胞过继转移给豚鼠后，不能抑制其迟发型超敏反应，首次证明了B细胞的负向免疫调控作用，该研究表明B细胞中存在一群具有免疫调节功能的B细胞亚群，但其具体分子生物学机制并未深入阐述。直到1996年，Wolf等[2]在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的小鼠模型中发现，与有自愈倾向的野生型小鼠相比，EAE可使B细胞缺陷的C57BL/6小鼠疾病进一步进展，表明小鼠体内可能存在抑制炎症反应的B细胞亚群。此后， 该群B细胞亚群引起研究者的广泛关注。进一步研究表明这群B细胞通过分泌调节性细胞因子（IL-10、TGF-β）等及细胞间接触等方式作用于其他免疫细胞，从而抑制免疫应答，这群B细胞称为调节性B细胞（Bregs）。相关资料中曾提及[3]，调节性B细胞能够通过对白细胞介素-10进行分泌的方式，发挥其抑制免疫应答的作用。若Bregs缺失与（或者）功能减弱，将会引发自身免疫性疾病，并能在一定程度上加重患者的病情[4]。故而，通过对免疫性血小板减少症患者的Bregs数量和功能进行检测，可为其病情程度的判断提供帮助并有助于指导治疗[5]。此研究中，本文将着重分析免疫性血小板减少症患者的调节性B细胞的数量与功能，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年10月～2018年7月就诊于湖州市中心医院初诊为免疫性血小板减少症的患者40例，作为A组，其中男21例，女19例;年龄25～70岁，平均（38.24±5.16）岁;血小板計数低于100×109/L。2016年10月～2018年7月期间本院接诊的完全缓解免疫性血小板减少症患者35例作为B组，其中男19例，女16例;年龄24～71岁，平均（39.02±5.84）岁;血小板计数为（100～300）×109/L。2016年10月～2018年7月期间本院接诊的健康体检者40名作为C组，其中男22例，女18例;年龄24～72岁，平均（38.97±5.46）岁。所有入选者均签署知情同意书，有完整的临床资料，依从性良好，获得医学伦理委员会批准。此研究排除依从性较差者、中途退出试验者以及未签署知情同意书者。各组的就诊时间以及性别构成比等基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）所用试剂和仪器。鼠抗人CD24抗体（经PE标记）、鼠抗人CD38抗体（经APC标记）、鼠抗人CD19抗体（经FITC标记）由“美国Becton Dickinson公司”提供，鼠抗人白细胞介素-10（经PerCP-Cy5.5标记）由“美国Biolegend公司”提供，各抗体的同型对照、破膜剂和溶血素由“美国BD公司”提供，FACSCalibur型流式细胞仪由“美国BD公司”提供。

（2）采取流式细胞术对外周血Bregs数量进行检测。取各组的外周静脉血约10 μL，经EDTA抗凝处理后，向血液标本中分别加入20 μL的鼠抗人CD38抗体、鼠抗人CD19抗体以及鼠抗人CD24抗体，并将之置于4℃的环境中进行孵育，待15 min之后再加入溶血素（1 mL）。避光放置10 min后，进行离心处理，控制离心时间为5 min，此后，再利用磷酸盐缓冲液进行洗涤，并按要求加入磷酸盐缓冲液，用量为300 μL。利用流式细胞仪对3万个细胞进行计数，同时对Bregs数量进行检测。

（3）采取流式细胞术对外周血Bregs功能分子分泌的白细胞介素-10的数量进行检测。取各组的外周静脉血约200 μL，经EDTA抗凝处理后，在血液标本中分别加入20 μL的鼠抗人CD38抗体、鼠抗人CD19抗体、鼠抗人CD24抗体与同型对照。于4℃的环境下进行避光孵育，待15 min之后再加入1 mL的溶血素，于避光放置10 min后进行离心处理，控制离心时间为5 min。此后，再加入600 μL的破膜剂，于室温且避光的环境中进行保存，10 min后，利用磷酸盐缓冲液（1 mL）进行洗涤，然后再分别加入5 μL的鼠抗人白细胞介素-10抗体与同型对照。于4℃、避光的环境下进行孵育，15 min后，经磷酸盐缓冲液进行洗涤后，加入磷酸盐缓冲液300 μL。利用流式细胞仪对5万个细胞进行计数，同时对Bregs细胞中的白细胞介素-10的表达水平进行检测。

1.3 治疗方法和疗效判断标准

针对此研究中所纳入的免疫性血小板减少症患者，均予以糖皮质激素治疗，泼尼松的每日用药量为1 mg/kg，并根据患者的病情状况，对部分患者辅以重组人血小板生成素与丙种球蛋白治疗，其中，重组人血小板生成素的每日用药量为300 IU/kg，连续治疗14 d，丙种球蛋白的每日用药量为400 mg/kg，连续治疗5 d。而免疫性血小板减少症的诊断和治疗效果判断均参考《血液病诊断及疗效标准》[6]中的相关内容。

1.4 评价指标

对A、B、C三组的检测结果进行分析和比较，包括外周血Bregs数量和功能以及外周血Bregs中白细胞介素-10的细胞比例。

1.5 统计学处理

本研究所有数据均采取SPSS20.0统计学软件进行数据处理，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验;计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bregs数量分析

A组的Bregs数量比B、C两组低，组间差异显著，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 外周血Bregs中白细胞介素-10细胞比例分析

A组Bregs水平、外周血Bregs中白细胞介素-10细胞比例均低于B组与C组，差异有统计学意义（P<0.05），同时B组Bregs水平、外周血Bregs中白细胞介素-10细胞比例低于C组健康体检者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

迄今为止，临床上还尚未能研究出免疫性血小板减少症的确切病因[7]，但有报道称，异常B淋巴细胞形成抗体乃免疫性血小板减少症的一个重要致病环节[8]。而Bregs则是机体免疫系统中比较重要的一个组成部分，其能够分泌白细胞介素-10，并由此起到对免疫系统进行负向免疫调节的作用，而Bregs数量的减少和功能的失调则极有可能会引发自身免疫性疾病，亦或者是加重患者的病情[9-11]。白细胞介素-10能够对从Th0细胞分化成为Th2细胞的过程进行诱导，可抑制CD4+T细胞向Th1、Th17细胞分化，同时可抑制Th1、Th17细胞的活化和分化，使得Th1/Th2失去平衡，促使CD4+T细胞向Treg细胞和Tr1细胞转化，并能够对树突状细胞对白细胞介素-6以及白细胞介素-12的分泌过程进行有效的抑制[12-15]。相关资料中提及[16]，对于免疫性血小板减少症患者来说，其Th17细胞数量明显增加，Th1/Th2出现极化异常的情况，且调节性T细胞水平明显降低。虽然IL-10是Bregs参与抑制免疫应答的主要细胞因子，但仍有一些其他因子，如TGF-β、IL-35、CD1d、CD80、CD86、PD-L1、CTLA-4、IDO、IgG4等参与辅助Bregs与其他免疫细胞相互作用，进而使Bregs发挥抑制免疫应答的功能[17]。

本研究中，A组的Bregs数量比B、C两组低，差异有统计学意义（P<0.05）;A组外周血Bregs中白细胞介素-10的细胞比例比B、C两组低，组间差异显著，差异有统计学意义（P<0.05）;B组外周血Bregs中白细胞介素-10的细胞比例比C组低，差异有统计学意义（P<0.05）。由此说明，免疫性血小板减少症的发生、发展过程当中，Bregs起着至关重要的作用，在临床治疗中，通过提高患者的Bregs水平及相关功能，有助于更好地缓解患者的病情，改善预后效果。

mDC能够对Th1免疫应答进行诱导，可加快细胞免疫发生的速度[18]。pDC和mDC能够通过分泌出的细胞因子进行相互抑制，对于免疫性血小板减少症患者来说，其机体中的pDC水平明显增加，从而对mDC进行有效的抑制，使得mDC水平明显降低[19]，表明mDC在免疫性血小板减少症的发生过程中可能起到了一定的推动作用[20]。相关资料中提及，对于免疫性血小板减少症患者来说，其Bregs和mDC为正相关的关系，表明Bregs和mDC有可能均参与免疫性血小板减少症的免疫病理过程;Bregs和外周血血小板計数表现出正相关的关系，表明Bregs水平和免疫性血小板减少症的发生与进展有着较为密切的关系。

Bregs的发现为研究免疫性血小板减少症开辟了一个新的领域。本研究发现，免疫性血小板减少症患者的Bregs数量和功能较完全缓解患者和健康人群均有明显降低，且同疾病的严重程度有着较为密切的关系。在免疫性血小板减少症的发生机制中，Bregs有着比较显著的推动作用，通过对Bregs数量和功能进行检测，能够为临床医师评估免疫性血小板减少症患者的病情及预后提供新的评判指标，且该研究结果有助于在临床工作中通过检测免疫性血小板减少症患者的Bregs数量及功能变化，更全面地评估患者疗效，同时为临床未来靶向治疗该疾病提供新的方向。

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（收稿日期：2018-09-25）