广东韶关地区163例男性不育患者Y染色体微缺失分析

黄文波 马占忠 范舒舒 徐静 罗慧旗 刘满霞 陈玉美

（1.韶关学院医学院医学技术系，广东 韶关 512026；2.汕头大学医学院附属粤北人民医院 检验科、产前诊断中心，广东 韶关 512026）

全世界约有15%的夫妇不育，50%与男性因素有关［1］。Y 染色体无精因子（azoospermia factor，AZF）微缺失是男性不育的重要遗传因素［2］。本研究采用荧光定量PCR技术对无精子或严重少精子患者的Y染色体AZF基因的6个序列标签位点进行检测，从分子水平探讨男性不育的病因，为临床辅助生殖提供依据和指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年10月在粤北人民医院就诊的163例无精或严重少精子的患者，年龄24～45岁（平均年龄31.6岁），无精症或严重少精症诊断参照 WHO诊断标准［3］。选取50例精液常规分析正常的健康男性为对照组，两组年龄差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 试剂Y染色体微缺失检测试剂（PCR荧光探针法）由上海透景生命科技股份有限公司生产，检测包括AZFa区的s Y84、s Y86，AZFb区的s Y127、sY134，AZFc区的sY254、sY255A以及SRY、ZFX／ZFY位点。核酸提取纯化试剂由江苏康为世纪生物科技有限公司生产。仪器：伯乐CFX96荧光定量PCR仪，IMPLEN Nano photometer N50 Touch微量分光光度仪等。

1.2.2 提取DNA，PCR扩增采集静脉血2 ml，EDTA抗凝；取200μl血液样本，用Blood Gen Mini Kit核酸提取试剂盒提取全血基因组DNA；用微量分光光度仪检测DNA OD260／OD280，要求在1.8～2.0之间。PCR反应体系：A组和B组分别加PCR预混液22.5μl，样本DNA模板2.5μl，设阴性对照和质控品。PCR反应条件：50℃2 min；95℃5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 cycles；72 ℃ 5 min；60 ℃ 时收集 FAM／VIC／ROX／Cy5荧光信号。具体步骤按照试剂盒说明书和相应SOP文件操作。

1.2.3 结果判读质控品结果为典型的S型扩增曲线且Ct＜32，阴性对照4个通道检测均无扩增曲线。其他样本位点结果为典型的S型扩增曲线且Ct＜32判为存在，否则判为缺失。

1.2.4 统计分析利用SPSS 19.0软件统计分析，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在163例男性不育患者中，共检出9例Y染色体微缺失，总检出率为5.52%。包括5例AZFc缺失，检出率为3.07%；3例为AZFb＋c缺失，检出率为1.84%；1例为 AZFa＋b＋c缺失，检出率为0.61%，该患者SRY基因阴性，外周血染色体核型结果为46，XX，为男性性反转患者。见表1和图1～4。对照组未检出Y染色体微缺失。两组间Y染色体微缺失检出率差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 163例男性不育患者Y染色体AZF微缺失检测结果（n＝163）

图1 健康男性AZF基因PCR扩增曲线

图2 AZFc缺失PCR扩增曲线

图3 AZFb＋c缺失PCR扩增曲线

图4 AZFa＋b＋c缺失且SRY（－）PCR扩增曲线

3 讨论

Y染色体AZF基因与精子发生密切相关，分为AZFa、AZFb、AZFc 3个区域，任何一个区域微缺失都会引起无精或少精子症。AZFa缺失表现为唯支持细胞综合征，为绝对的无精子症，AZFb缺失患者精子生成被阻滞在精母细胞阶段，没有精子生成，因此，AZFa缺失和AZFb缺失的患者都不能通过单精子胞浆内注射，只能选择供精的方式来生育后代。AZFc缺失是临床上最常见生精障碍的病因，AZFc缺失患者的临床表现多样，有些能生成精子，可以通过辅助生殖技术生育后代，但是会将AZFc缺失遗传给男胎，可通过遗传咨询告知风险或者选择女胚进行移植避免遗传缺陷［4］。

本研究在广东韶关地区163例无精或严重少精子患者中检出9例Y染色体微缺失，总检出率为5.52%，AZFc缺失最常见，与国内外报道的AZFc缺失发生率最高的结论一致［5，6］。亚洲地区男性不育患者中AZF微缺失的发生率在2%～19.4%［7］。广东省内报道的Y染色体微缺失率由高到低依次是东莞地区19.2%［8］，深圳地区10%～14.29%［9，10］，广州地区5.3%～10.9%［11，12］，惠州地区9.02%［13］，潮州地区7.14%［14］，佛山地区6.6%［15］。各文献报道的检出率差异较大，与所选的研究对象和采用检测方法和位点不尽相同有关，也可能存在种族和地域的差异。

目前，Y染色体微缺失可采用荧光定量PCR法、PCR琼脂糖凝胶电泳法、毛细管电泳法、基因芯片法和荧光原位杂交法等，本文所用的荧光定量PCR法自动化程度高，操作简便，不需要电泳等繁琐的步骤，是一种简便高效的检测方法。但有文献报道基因多态性可能会导致扩增失败引起假阳性的风险需引起重视［16，17］，必要时采用 PCR 毛细管电泳测序确认。

欧洲男科协会和分子遗传质量协作网EAA／EMQN出版的指南［18］，首次提出了AZF筛查的规范化流程、遗传咨询和辅助生殖等相关内容。Y染色体微缺失分析已经成为一项常规的检查项目，可明确无精子症或少精子症患者的病因、指导选择辅助生殖方式，对实现优生优育具有重要意义。