绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠肾皮质基因表达谱的影响研究

郎志芳 王洪伟 李姝 刘兰涛

[摘要] 目的 探讨绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠皮质基因表达谱的影响。 方法 选取30只大鼠为实验样本，制作20只DN模型后分为对照组和观察组，对照组为DN大鼠参考组，观察组DN大鼠则应用绞股蓝总皂苷进行治疗，对比两组DN大鼠肾皮质基因表达谱差异。 结果 观察组大鼠与对照组大鼠肾皮质基因表达上存在差异，差异基因132条，其中31条上调基因，133条下调基因。 结论 绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠皮质基因表达谱有明显影响，可改变其基因表达，改善其糖尿病症状和免疫机能。

[关键词] 绞股蓝总皂苷；糖尿病肾病；肾皮质基因表达

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2018）11（a）-0169-02

糖尿病肾病是常见的糖尿病并发症之一，也是糖尿病患者晚期常见的致死性并发症。截止到目前为止，尚未在研究中明确糖尿病肾病的发病机制，通常认为与糖代谢异常、高血压、肾组织血管活性物质、机体生长因子、机体化学趋化因子、遗传等因素有关。绞股蓝总皂苷是一种提取自葫芦科植物绞股蓝的活性物质，具有良好的抗高血脂、抗动脉中样硬化、降血糖、抗肿瘤、清除氧自由基等功效，有学者指出绞股蓝总皂苷可有效降低糖尿病肾病小鼠血糖，改善糖尿病小鼠肾功能，因此为探究绞股蓝总皂苷对DN大鼠肾皮质基因表达谱的影响，展开该次研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 模型鼠制备及分组

共选取30只大鼠进行实验，均为正常环境下培育。其中20只切除所有大鼠单侧肾后行STZ注射制作改良DN大鼠模型，随机分为对照组和观察组，每组10只。另外10只实验用大鼠不做特殊处理，作为正常参考组。

对照组10只DN大鼠每日使用0.5 g/kg生理盐灌胃，观察组10只DN大鼠每日使用0.5 g/kg绞股蓝总皂苷灌胃，参考组10只正常大鼠每日使用0.5g/kg生理盐进行灌胃，灌胃1次/d，连续灌胃4周，于4周后对比3组大鼠肾皮质基因表达谱变化。同时纳入实验大鼠均为单笼饲养，进水、进食为过剩补给，有大鼠自主选择进食和进水时机。

1.2 实验及标记方法

使用“一步法”抽提观察组大鼠肾皮质总RNA，采用Oligotex mRNA Midi Kit纯化mRNA，利用反转录标记cDNA探针并纯化。直接标记大鼠cDNA，其中对照组大鼠RNA使用Cy3荧光标记，观察组大鼠RNA使用Cy5荧光标记。

1.3 杂交与洗涤

基因芯片（来源于上海博兴基因芯片有限公司）和杂交探针分别置于95℃水中，水浴5 min使之变性，并将探针加在基因芯片上，盖玻片封片后将基因芯片置于60℃水中杂交，持续15～17 h，杂交完成后揭开盖玻片，并使用2*SSC+02%*SDS、0.1%SSC+0.2%SDS、0.1%SSC洗涤，分别洗涤10 min，室温下晾干待检。

1.4 检测与分析方法

使用激光共聚焦扫描仪获取16-bit tiff图像文件，使用ImaGene3.0软件分析对照组Cy3荧光标记信号以及观察组Cy5荧光信号强度变化和比值。通常以Ratio值在0.5～2.0之间为基因表达不存在显著差异，此范围之外为基因表达发生显著改变，差异筛选标准Ratio为Cy5/Cy3，当Ratio>2.0表示基因上调，<0.5则提示基因下调。

2 结果

2.1 检测指标对比

预定实验周期4周，即于第28天测定3组大鼠的血糖、尿蛋白、血肌酐水平，结果表明对照组和观察组大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白均高于正常参考组，同时观察组大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白水平低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），这提示绞股蓝总皂苷可有效降低DN大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白水平。见表1。

2.2 基因芯片扫描结果

对处理好的基因芯片进行扫描，获得图像后将观察组和对照组大鼠图像进行叠加后扫描，结果显示Cy3与Cy5荧光标记信息获取数量越多时两者间差异越大，这提示对照组大鼠和观察组大鼠肾皮质基因表达谱在局部具有相似性，整体上仍存在较大差异。

2.3 差异表达基因筛选结果

对2.2中的结果进行深度分析后，发现在肾皮质基因表达谱上观察组和对照组共存在132条差异表达基因，根据预定Ratio值进行划分，其中133条下调基因，31条上调基因。其中可以明确的下调基因有糖基化終末受体基因、唾液酸转移酶基因、涎酸转移酶基因、胰高血糖素受体基因、肾小球系膜区细胞外基质聚集相关基因等，其中以胰高血糖素受体基因下调最明显，可以明确的上调基因有丝氨酸蛋白抑制剂2b基因。见表2。

3 讨论

有研究指出糖尿病肾病形成和发展与晚期糖基化终末产物有较大联系，其与机体内多种蛋白质都可发生非酶糖基化变化，使其结构、强度、溶解性、配位、交联性质发生改变，从而诱发糖尿病肾病，因此也有学者认为晚期糖基化终末产物是糖尿病肾病发病的致病因子。当然糖尿病肾病的发生和对肾皮质基因表达谱的影响不仅仅局限于bank编号为NM-053336的晚期糖基化终末产物受体（RAGES），还对文中前述唾液酸转移酶基因、涎酸转移酶基因、胰高血糖素受体基因、肾小球系膜区细胞外基质聚集相关基因等基因表达有影响，但其中以糖基化终末受体最为典型，这与RAGES自身特点有密切联系。

蛋白质的糖基化具有明显的组织特异性，在发育过程中受糖基转化酶活性的影响，其中唾液酸转移酶与涎酸转移酶的活性增加后会增加糖基化终末产物的产量。而糖基化终末产物（AGEs）可通过直接或间接两种途径对肾脏造成损伤。其直接作用如下，通过炎细胞介导造成基质扩张和肾小球硬化，引起肾小球基底膜支架结构孔径增大、通透性升高而引起蛋白尿，但此种直接损伤的程度相对有限，常见的损伤机制仍以间接为主，即通过与受体结合来释放多种有害因子累及肾脏，使肾脏肥大、肾小球硬化、间质纤维化等，因此从某种意义上来说抑制糖基化终末受体的产生可有效阻断AGEs对肾脏的损伤，从而保护糖尿病机体的肾脏功能。

在该组研究中，用于治疗DN大鼠的绞股蓝皂苷是一种提取自葫芦科植物绞股蓝的活性物质，以灌胃的方式应用与实验，发现应用后DN大鼠肾皮质基因表达谱发生改变，其中主要的几项与糖尿病肾病形成和发展的基因均下调，这提示绞股蓝总皂苷具有明确延缓DN病理进程的功效，因此具有临床应用的潜力。当然高血糖仍是糖尿病肾病发生的始动因素，应用绞股蓝只是能够有效延缓病情进展，想要完全治愈DN仍需要长期的降糖治疗。

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（收稿日期：2018-08-05）