不同剂量消瘀散结抑癌灌肠剂对人前列腺癌移植瘤裸鼠的影响

王志刚，汪 珊

（广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

前列腺癌作为泌尿外科常见的恶性肿瘤疾病，近年来在我国的发病率逐年上升，且大多数患者确诊前列腺癌时往往已错过手术治疗的最佳时机。根据肿瘤分期，往往采用以药物去势作为主要手段的内分泌治疗方法。但随着治疗的不断深入，很多患者发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。目前CRPC治疗在国内外均没有统一标准和方案，而中医药的优势日渐凸显。

PC3细胞是从人前列腺癌骨转移肿瘤中分离出来的，被广泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。目前我们对晚期前列腺癌和雄激素非依赖阶段的前列腺癌相关的发病机制知之甚少，尚无有效的治疗方法，相关研究仍然处于摸索阶段［1］，PC3细胞也是目前常用的前列腺癌细胞之一。

消瘀散结抑癌灌肠剂是我院的经验方，在前列腺癌的临床治疗中应用广泛。本研究以人前列腺癌裸鼠移植瘤模型为对象，通过对裸鼠皮下注射体外培养的人前列腺癌PC3细胞悬液进行接种造模，成功建立人前列腺癌移植瘤模型，从裸鼠体质量、摄食量变化、肿瘤体积、抑瘤率等方面系统观察不同剂量下消瘀散结抑癌灌肠剂对人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 PF级BALB/C（nu/nu）裸鼠59只（广州中医药大学第一附属医药SPF级动物实验室），4 w 龄，16～20 g，雄性。合格证号：粤监证字2008C067号。

1.1.2 仪器与试剂 RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液（双抗）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Gibco公司）；PBS磷酸盐缓冲液、台盼蓝溶液（Hyclone）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies）；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；β-actin单克隆抗体（Abcam公司批号Ab8227）；PTEN鼠单克隆抗体（Abcam公司 批号 Ab79156）；HRP标记的山羊抗鼠二抗（CST公司批号 #7076）；RIPA裂解液、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（博士德）；PMSF、Tris、甘氨酸、SDS（Sigma）；-80℃低温冰箱（SANYO）；超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；电热恒温水温箱（上海跃进医疗器械厂）；一次性细胞塑料培养瓶、一次性移液管、冻存管、离心管（Corning）等。

1.1.3 实验药物 消瘀散结抑癌灌肠剂由山慈菇30 g，夏枯草 30 g，莪术 30 g，虎杖 30 g，吴茱萸 15 g组成（相当于中剂量组0.87 g/mL），购于广州中医药大学第一附属医院中药房。将中药用蒸馏水煎煮浓缩后制成高、中、低3个浓度水煎剂，置于4℃冰箱保存备用。

1.2 实验方法

将59只荷瘤裸鼠随机分为对照组，消瘀散结抑癌灌肠剂低、中、高剂量组4组。人前列腺癌PC-3细胞培养完成后保存细胞悬液，对裸鼠进行细胞接种，在非麻醉状态下，腹卧位固定裸鼠，用75%酒精棉球对小鼠右耳后侧及颈背部皮肤进行消毒处理，后用镊子提起裸鼠颈部皮肤，用注射器注入PC3细胞悬液0.2 mL，并用镊子轻轻夹住针刺部位数秒钟后再次对注射部位消毒即完成。前列腺癌裸鼠模型完成后，于细胞接种后第10天开始灌肠，灌肠前对各组裸鼠禁食6 h。消瘀散结抑癌灌肠剂按照人和小鼠间等效剂量比率换算小鼠的等效剂量，按照低剂量组0.44 g/mL、中剂量组0.87 g/mL、高剂量组1.74 g/mL进行给药，对照组给予等剂量生理盐水，灌肠剂量按照每只0.02 g/mL，隔天1次，共30 d。

1.3 观察指标

①观察体外培养的人前列腺癌PC3细胞株增长状态。②观察各组裸鼠细胞接种后精神活动状态，进食进水情况，接种部位变化，体质量外形变化。③观察消瘀散结抑癌灌肠剂对裸鼠前列腺癌移植瘤的抑瘤作用，包括抑瘤率和肿瘤体积变化。

于治疗当日和治疗开始后每5 d用游标卡尺测量1次皮下移植瘤的长径a和短径b，观察记录相关数据。30 d后，将小鼠脱颈处死，取肿瘤瘤体，计算肿瘤体积（V）和肿瘤生长抑制率（Y）。

1.4 统计学方法

应用SPSS19.0统计软件系统对数据进行统计学分析。各组计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组样本采用独立样本t检验，以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

图1 裸鼠肿瘤外观

细胞接种后，裸鼠右侧颈背部见大约0.5 cm×0.5 cm的皮丘，无破溃，无渗出。小鼠在实验初期在精神和形态方面均与正常小鼠无异且摄食正常，约5～7 d于原肿瘤细胞接种部位出现肉眼可见粒状突起物，随后肿物快速增长，约10 d左右小鼠肿瘤体积均可达10 mm3以上，成瘤率100%（图1）。随着肿瘤体积变大，小鼠逐渐出现精神萎靡，反应迟钝，摄食进水量减少，行动缓慢。4 w时，上述表现越发明显，少数裸鼠体质量开始减轻，呈恶病质表现。

2.2 消瘀散结抑癌灌肠剂对裸鼠前列腺癌移植瘤的抑瘤作用

2.2.1 裸鼠30 d摄食和体质量变化 用药前消瘀散结抑癌灌肠剂各剂量组与对照组体质量比较差异无统计学意义。给药完成后，消瘀散结抑癌灌肠剂各剂量组与对照组裸鼠体质量比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表 1。

表1 两组裸鼠灌肠前后体质量变化 （±s）

表1 两组裸鼠灌肠前后体质量变化 （±s）

注：与对照组比较，P＜0.05，P＜0.01

组别 n 灌肠前(g) 灌肠后(g)对照组 15 19.49±1.16 17.67±.37消瘀散结抑癌灌肠剂低剂量组 14 20.09±1.33 18.83±1.381）消瘀散结抑癌灌肠剂中剂量组 15 20.31±1.24 23.58±2.372）消瘀散结抑癌灌肠剂高剂量组 15 19.98±1.22 24.69±2.642）1）2）

2.2.2 荷瘤裸鼠肿瘤体积的变化 给药前4组小鼠肿瘤体积大小比较差异无统计学意义（P＞0.05），治疗结束后，消瘀散结抑癌灌肠剂中剂量组、高剂量组与对照组肿瘤体积比较差异有统计学意义（P＜0.05），消瘀散结抑癌灌肠剂低剂量组肿瘤体积与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；消瘀散结抑癌灌肠剂低、中、高剂量组对肿瘤体积的抑制率呈现上升趋势，可见不同剂量灌肠对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用有一定的量效关系。结果见表2。

表2 不同剂量裸鼠肿瘤体积、抑瘤率比较 （±s）

表2 不同剂量裸鼠肿瘤体积、抑瘤率比较 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

组别 肿瘤体积（cm3） 抑制率（%）治疗前 治疗后对照组 0.11±0.05 1.29±0.27 -消瘀散结抑癌灌肠剂低剂量组 0.12±0.06 1.21±0.37 6.20消瘀散结抑癌灌肠剂中剂量组 0.09±0.04 1.01±0.411） 21.71消瘀散结抑癌灌肠剂高剂量组 0.10±0.05 0.99±0.381） 23.26

2.2.3 荷瘤小鼠30 d摄食量变化 各组荷瘤小鼠摄食量在接种4 w后，对照组裸鼠平均体质量逐渐下降，消瘀散结抑癌灌肠剂各剂量组裸鼠平均体质量总体仍呈增长趋势，消瘀散结抑癌灌肠剂低、中、高剂量组平均摄食量高于对照组，可见灌肠给药在一定程度上提高了小鼠的生存质量。结果见表3。

表3 不同剂量组荷瘤小鼠进食量变化 （g）

3 讨论

消瘀散结抑癌灌肠剂作为中药复方制剂，在我院临床已经广泛使用，是严格遵守中医辨证理论，同时建立在临床研究和药理实验基础上，经过长时间临床观察验证的一组自拟经验方，由山慈菇、夏枯草、莪术、虎杖、吴茱萸5味药物组成，是我院前列腺癌治疗中常用的经典方。诸药合用清热散结，其组成符合前列腺癌气血凝滞、痰浊结聚、邪毒壅积的病理基础。君药山慈菇清热解毒、消痈散结，山慈菇多糖具有一定的抗肿瘤作用，其作用机制可能与免疫调节及相关蛋白表达存在一定的关联［2］。臣药夏枯草清火明目、散结消肿，其主要活性化学成分是三萜类、黄酮类、甾体类、香豆素类等，具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等药理作用。莪术、虎杖行气破血，消积止痛，莪术的药用发现始载于《唐本草》，研究表明莪术油中主要的抗肿瘤活性单体成分是β-榄香烯，不仅对非瘤性的白血病细胞具有抑制其增殖，诱导其凋亡的作用，也可以使众多的实体瘤细胞的凋亡率明显提高，增殖率明显下降［3］。呋喃二烯对10种人肿瘤细胞的体外增殖有抑制作用［4］，且抑制率随药物剂量的增加而增加，有显著的剂量依赖性和较强的细胞毒性。虎杖中含有的白藜芦醇的多种药理作用中最引人注目的是抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用表现为对肿瘤的起始、促进和发展3个阶段均有抑制作用。白藜芦醇可通过多种机制对多种肿瘤细胞产生不同程度的拮抗作用［5］。吴茱萸温中开郁行气，吴茱萸碱可对多种肿瘤细胞产生毒性作用，具有抗肿瘤活性，如前列腺癌PC3细胞，相关机制可能与吴茱萸碱抑制肿瘤细胞增殖，阻断细胞周期，通过Caspase 依赖途径诱导凋亡有关［6］。

消瘀散结抑癌灌肠剂在临床中疗效得到了认可。有临床观察发现在最大限度雄激素阻断治疗（MAB）同时予以消瘀散结抑癌灌肠剂灌肠2个月后，比单纯MAB治疗可明显降低前列腺癌患者血清PSA，改善尿流率，一定程度上抑制或延缓肿瘤的转移［7］。中药复方配比、制作过程及流程相对简单，故用中药灌肠治疗疾病较为普遍，中药制剂和化疗药物联合灌肠在提高免疫功能以及对直肠癌局部症状的缓解上具有协同性，通过适当直肠给药，可避免肝脏首过效应，直肠吸收比口服吸收慢，可以延长药物作用时间，可起到局部和/或全身作用［8］。本实验用低、中、高剂量的消瘀散结抑癌灌肠剂对肿瘤细胞株PC3接种成功的BALB/C（nu/nu）裸鼠进行灌肠后，中、高剂量组裸鼠肿瘤体积与对照组比较明显减小（P＜0.05），低剂量组与对照组比较差异无统计学意义；低、中、高剂量组抑瘤率分别为6.20%、21.71%、23.26%，可见消瘀散结抑癌灌肠剂可以抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的增长，抑瘤率与药物浓度成正比，高、中剂量组的抑瘤率比较接近，两组荷瘤裸鼠摄食量也有所增加；给药后低、中、高剂量组体质量与对照组比较均出现缓慢增长，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），说明荷瘤小鼠的生存质量得到改善。综上分析，消瘀散结抑癌灌肠剂可以提高荷瘤裸鼠的生存质量，抑瘤率与药物浓度成正相关。荷瘤裸鼠体质量和摄食量变化同样受到药物剂量影响。

消瘀散结抑癌灌肠剂是我院临床使用较为成熟的经验方之一，本次研究的体外移植瘤裸鼠模型并不能全面反映药物在人体内的抑瘤作用，实验对4个分组裸鼠的体质量变化、摄食改变、抑瘤率和肿瘤体积进行了比较研究，具有一定局限性。

实验中我们用输尿管导管制作的灌肠器操作简便安全，并能根据裸鼠大小调整型号，有效防止了实验动物的意外受伤和死亡，尽可能保证了实验数据的准确性。低、中、高3个剂量组设计参考了临床用药剂量，丰富了不同剂量的实验数据，为临床用药提供了一定参考，其对前列腺癌的抑制作用机制将在下一步研究中继续完善。