液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素残留量的不确定度

◎ 陈梅斯，练习中，郑丽斯

（江门市食品检验所，广东 江门 529000）

1 实验部分

1.1 主要仪器设备与试剂

1.1.1 仪器设备

液相色谱-串联质谱联用仪（API4000，美国AB公司）、液相色谱柱（Shim-pack XR-ODS 3.0 mm×75 mm，2.2 μm)、振荡器（上海南汇横沔厂）、固相萃取装置（AB-1110，美国Abel）、电子天平（JJ-2000B，常熟市双杰测试仪器厂）、旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）、水浴氮吹仪（WD-12，杭州奥盛仪器有限公司）。

1.1.2 试剂

氯霉素标准品、氯霉素-D5标准品，无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯，乙酸乙酯、甲醇为色谱纯。

1.2 测试方法

按照SN/T 1864-2007《进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法 液相色谱-串联质谱法》的规定，本法使用内标法对样品中氯霉素残留量进行定量。实验操作方法如下：称取5.00 g蜂蜜试样置于50 mL具塞离心管中，准确加入0.1 mL氯霉素-D5（10 ng·mL-1）内标溶液，加15 mL 15%氯化钠水溶液，加25 mL乙酸乙酯后振荡提取1 min，离心取上层乙酸乙酯提取液过无水硫酸钠柱，收集于浓缩瓶中，样品残渣中再加入20 mL乙酸乙酯重复上述操作，合并乙酸乙酯提取液在50 ℃水浴旋转蒸发浓缩至近干，用4 mL水溶解浓缩物后过C18固相萃取柱净化，再用10 mL水分两次洗涤浓缩瓶，洗涤液均过固相萃取柱，经淋洗后，最后用6 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮吹仪浓缩近干后加10 mL50%甲醇水溶液溶解，过滤膜后上机测定。

2 不确定度的评定

2.1 数学模型

样品中的氯霉素残留含量按式（1）计算：

式（1）中：X-样品中氯霉素的残留量，单位为μg·kg-1；c-从标准曲线上得到的氯霉素溶液浓度，单位为ng·mL-1；V-样液最终定容体积，单位为mL；m-最终样液代表的试样的质量，单位为g。

2.2 不确定度的来源

①本法使用内标法进行定量，从标准曲线上得到的溶液浓度引入的不确定度主要来自以下4个方面：氯毒素和内标峰面积之比的不确定度、标准曲线斜率a及截距b的不确定度、内标工作液浓度cis的不确定度以及加入样品中内标工作液体积Vis的不确定度。因以上不确定度主要来源于实验过程中人员操作、试剂、损失因子等变动性较大的因素，很难精确评估，因此采用A类方法评定为主，B类评定为辅。②最终定容的体积及温度对体积的影响引入的相对不确定度，采用B类方法评定。③称量样品时天平引入的相对不确定度，采用B类方法评定。

2.3 不确定度分量的评定

2.3.1 从标准曲线上得到的氯霉素溶液浓度的相对不确定度u(c)

2.3.1.1 氯霉素和内标峰面积之比的不确定度u(y)样液中氯霉素和内标峰面积之比可以通过实验直接读取，与线性回归无关，其不确定度来源于方法精密度，人员操作、污染因子等所导致的峰面积之比的变动性，因此采用A类评定。根据实验方法测定n个平行样品，得到n个仪器响应值。对这n次平行实验结果进行统计运算，其标准偏差s(y)作为不确定度u(y)。本实验在相同条件下，连续测定10个样品，10次测定峰面积比的平均值A=0.448，根据公式计算得氯霉素和内标峰面积之比的不确定度u(y)：

2.3.1.2 斜率a及截距b的标准不确定度u(a)、u(b)

上述的数学模型是在假设回归方程为y=ax+b的前提下建立的。斜率和截距的不确定度主要包括由每个实验点的不确定度和实验点相对最佳拟合直线的分散性所引起的不确定度。按照标准配制氯霉素浓度为0.05、0.1、0.4、0.8 ng·mL-1和 1.2 ng·mL-1，内标浓度为0.1 ng·mL-1的标准溶液，对5个标准点平行测定3次：由标准点的测定数值计算可得拟合方程为y=0.611 2x+0.002 2（r=0.999 9）。

按式

计算得s(y)=0.00162

公式中：yji-仪器上所得氯霉素与内标峰面积之比，yi-对应浓度的回归方和计算值，m-标准点的数目，n-重复测定的次数。

2.3.1.3 内标工作液浓度cis的不确定度u(cis)

由于内标是100 μg·mL-1浓度的D5氯霉素储备液，因此内标工作液的不确定度由两部分构成，内标定值引入的不确定度和由内标储备液配制工作液引入的不确定度。

（1）内标定值引入的相对标准不确定度u(is)。证书给定的定值最大允差为±1%，按照均匀分布，

（2）配制内标工作液引入的相对标准不确定度u(is)2。内标工作液按如下步骤配制：移取1.00 mL内标储备液至50 mL容量瓶，定容后配成20 μg·mL-1内标中间液，然后再移取0.25 mL内标中间液定容至50 mL配成10 ng·mL-1内标工作液。

①由1.00 mL移液管引入的相对标准不确定度u(1.00)

A级1.00 mL单标移液管允差为±0.005 mL，按均匀分布，

②由50 mL容量瓶引入的相对标准不确定度u(50)

50 mL A级单标线容量瓶的最大容量允差为±0.05 mL，按均匀分布，

由容量瓶校准温度与使用温度差别引入的不确定度分量u(50)2，20 ℃时水的体积膨胀系数α为2.1×10-3℃-1，校正温度为20 ℃，而本次实验是在恒温25 ℃条件下进行的，取均匀分布k=，则

合成50 mL容量瓶引入的不确定度：

③由0.50 mL分度吸量管引入的相对标准不确定度u(0.50)

0.50 mL A级分度吸量管的最大允差为±0.005mL，按均匀分布，

④因为在配制过程中使用2次50 mL容量瓶，因此配制内标工作液引入的相对标准不确定度u(is)2

合成内标工作液浓度cis的不确定度u(cis)，

2.3.1.4 加入样品中内标工作液浓度Vis的标准不确定度u(Vis)

样品中加入内标工作液的体积Vis为0.10 mL，0.5 mL多标移液管的最大允差为±0.005 mL，按均匀分布k=，计算得：

2.3.1.5 合成不确定度u(c)

2.3.2 最终定容体积引入的相对不确定度u(V)

样品经萃取、净化和氮吹浓缩近干后，用5.00 mL单标移液管移取50%甲醇水溶液溶解后过滤膜上机测试。5 mL单标移液管的B级容量允差为0.020 mL，按均匀分布k=，计算得：

2.3.3 称量样品（m）引入的相对不确定度u(m)

采用百分之一分析天平称量样品5.00 g，由检定证书给出其分度值为0.01 g，取均匀分布k=，则

2.3.4 合成不确定度u(X)及扩展不确定度u

样品中氯霉素残留量面积比的平均值A=0.448，按拟合方程y=0.6112x+0.0022计算得

取置信水平为95%，包含因子k=2，则

u=2×u(X)×X=0.025 1 μg·kg-1

修约为 u=0.025μg·kg-1

则蜂蜜中氯霉素残留量的测定结果为（0.729±0.025） μg·kg-1。

3 结论

在蜂蜜中氯霉素残留量测定中不确定度来源的评定中，对该过程中部分不确定度的来源进行了合理忽略，主要氯毒素和内标峰面积之比的不确定度、标准曲线斜率a及截距b的不确定度、内标工作液浓度cis的不确定度以及加入样品中内标工作液体积Vis的不确定度、最终定容体积的不确定度以及称取样品引入的不确定度等7个方面对测定结果进行了不确定度评定。从统计数值分析，不确定度的主要来源氯霉素和内标峰面积之比的不确定度和内标浓度的不确定度，应采取适当措施，尽可能减少由此引入的不确定度。