氯通道在葛根素注射液致溶血反应中的作用*

蒋奉奇， 袁 莹， 向祚君， 黄攀蕊， 邬 赫， 王诗琪， 王 娟 ，彭 晖， 罗 海

(1. 湖南医药学院生理学教研室， 2. 湖南医药学院临床技能实训中心， 怀化 418000)

葛根素注射液(puerarin injection)是一类药理作用广泛的中药单体注射剂，临床常用于辅助治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、糖尿病及其并发症等[1-3]。该药自1993年上市以来，已有多例引起急性血管内溶血的报道，严重者可因器官功能衰竭而死亡[4]。目前，葛根素注射液致溶血反应的机制仍不明确。文献报道，葛根素注射液溶血反应属药源性非免疫性溶血，可能与葛根素影响红细胞渗透压、改变红细胞形态以及降低红细胞膜稳定性有关[5-7]。

氯通道在红细胞膜表面大量表达，可通过影响Cl-、有机渗透物、水等物质跨细胞膜转运，影响细胞内外渗透压，进而调控细胞容积稳定[8]。葛根素注射液溶血作用是否与氯通道调控途径相关，国内外尚无文献报道。本文旨在探讨氯通道在葛根素注射液致溶血反应中的作用，为基于离子通道途径防治葛根素注射液溶血反应提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

葛根素注射液(方明药业集团，产品批号1511217)内含葛根素100 mg/2 ml，作为母液常温保存。使用时用生理盐水(NS)稀释到工作浓度。氯通道阻断剂他莫昔芬(Tamoxifen，Tam)购自Sigma-Aldrich公司(货号T5648)，用甲醇配制成50 mmol/L储存液常温保存，使用时稀释至20 μmol/L。ATP注射液(湖北天药药业股份有限公司，产品批号41603228)含三磷酸腺苷二钠20 mg/ml，做氯通道阻断剂使用时稀释成10 mmol/L，做氯通道激动剂使用时稀释成50 μmol/L，实验当天配制。

1.2 红细胞悬液的制备

心脏穿刺采集健康日本大耳白兔新鲜全血5 ml，肝素钠(1000 IU/ml)250 μl抗凝。使用低速离心机(TD5A，长沙湘仪)1 500 r/min离心5 min，吸去血浆层，加入生理盐水(NS)混匀。再以同样转速离心，重复 3 次，直至离心后上清液透亮。去掉上清液，然后取 20 μl压积红细胞用NS稀释至 1 ml混匀，得到2%红细胞悬液用于实验。

1.3 实验分组

实验分组⑴葛根素注射液组：葛根素注射液浓度分别为0.75、1.5、3、6 和12 mg/ml；⑵葛根素注射液 + 氯通道阻断剂组：3 mg/ml葛根素注射液 + 20 μmol/L Tam组、3 mg/ml葛根素注射液 + 10 mmol/L ATP组；⑶葛根素注射液 + 氯通道激动剂组：3 mg/ml葛根素注射液 + 50 μmol/L ATP；⑷生理盐水阴性对照组；⑸蒸馏水阳性对照组；⑹药物自身对照组：20 μmol/L Tam组、10 mmol/L ATP组、50 μmol/L ATP组。每组采集3个以上样本进行重复。将上述各组样品放入37℃恒温水浴箱(DK-98-Ⅱ，天津泰斯特)孵育6 h。

1.4 红细胞溶血率的检测与计算

孵育结束后，将各组样品1 500 r/min离心5 min。小心取出上清液，摇匀，按150 μl/孔加入96孔板，每组设三个平行对照。使用酶标仪(LB942 ，德国Berthold)检测540 nm吸光度，并按以下公式计算溶血百分率：溶血百分率=(OD 样品-OD 阴性)/(OD 阳性-OD 阴性) ×100%。其中，OD 阳性表示蒸馏水组完全溶血的OD 值；OD 阴性表示NS组完全未溶血的OD 值；OD 样品表示样品某个浓度的OD 值。各组样本去除上清液后剩余的细胞沉淀，加入NS稀释至1 ml，取其中500 μl细胞悬液用于流式细胞仪(Cytoflex，美国Beckman)检测溶血率；另外500 μl细胞悬液置于倒置显微镜(NIB-100F，宁波永新)下，使用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0，美国Media Cybernetics)拍摄并观察红细胞变化。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 葛根素注射液的浓度依赖性溶血作用

本实验研究了5种不同浓度葛根素注射液对家兔红细胞的影响。酶标仪检测结果显示(表1)，与NS组相比，0.75 mg/ml葛根素注射液组无明显溶血作用(n=3,P> 0.05)；而当葛根素注射液提高至1.5 mg/ml时，溶血率为(7.45±0.71)%，表现出溶血效应(n=3,P<0.05)；随着葛根素注射液浓度增加，其溶血作用相应增强(n=3，P<0.01)，3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml时溶血率分别为(17.16±3.32)% 、(33.44±5.40)% 、(57.76±6.62)%。这与样品直接观察及细胞图像系统记录的结果一致(图1)。流式细胞仪检测结果与此类似(图2、表1)。上述结果均提示，一定浓度的葛根素注射液可诱导红细胞体外溶血，且作用呈浓度依赖性。

Fig.1The hemolysis induced by puerarin injectioninvitro

Fig.2Flow cytometric analysis of hemolysis induced by different concentration of puerarin injection

A： NS group; B： 0.75 mg/ml puerarin injection group; C： 1.5 mg/ml puerarin injection group; D： 3 mg/ml puerarin injection group; E： 6 mg/ml puerarin injection group; F： 12 mg/ml puerarin injection group

GroupHemolytic percentage (%)Microplate readerFlow cytometryNS0.19±0.030.63±0.410.75 mg/ml puerarin injection0.39±0.060.80±0.341.5 mg/ml puerarin injection7.45±0.71∗8.28±0.57∗3 mg/ml puerarin injection17.16±3.32∗∗##18.83±1.31∗∗##6 mg/ml puerarin injection 33.44±5.40∗∗ΔΔ34.35±3.45∗∗ΔΔ12 mg/ml puerarin injection57.76±6.62∗∗++56.93±7.28∗∗▲▲

*P<0.05,**P<0.01vsNS group;##P<0.01vs1.5 mg/ml puerarin injection group;ΔΔP<0.01vs3 mg/ml puerarin injection group;▲▲P<0.01vs6 mg/ml puerarin injection group

2.2 氯通道阻断剂抑制葛根素注射液的溶血作用

酶标仪、流式细胞仪检测结果显示(图3、表2)，与3 mg/ml葛根素注射液组溶血率相比，3 mg/ml葛根素注射液 + 20 μmol/L Tam组(n=3)、3 mg/ml葛根素注射液 + 10 mmol/L ATP组(n=5)溶血率均显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。这些结果提示，用氯通道阻断剂关闭氯通道，可部分抑制葛根素注射液诱导的红细胞溶血。

2.3 氯通道激动剂增强葛根素注射液的溶血作用

酶标仪、流式细胞仪分析结果显示(图3、表2)，与3 mg/ml葛根素注射液组溶血率相比，3 mg/ml葛根素注射液 + 50 μmol/L ATP组溶血率显著增强，差异有统计学意义(n=4，P<0.01)。结果提示，用氯通道激动剂激活氯通道，可增强葛根素注射液诱导的红细胞溶血。

Fig.3Flow cytometric analysis of hemolysis after treatment with chloride channel blockers and agonists

A： 3 mg/ml puerarin injection group; B： 3 mg/ml puerarin injection+20 μmol/L tamoxifen group; C： 3 mg/ml puerarin injection+10 mmol/L ATP group; D： 3 mg/ml puerarin injection+50 μmol/L ATP group

GroupnHemolytic percentage (%)Microplate readerFlow cytometry3 mg/ml puerarin injec-tion 317.16±3.3218.83±1.313 mg/ml puerarin injec-tion+20 μmol/L Tam 35.17±0.57∗∗6.69±1.04∗∗3 mg/ml puerarin injec-tion+10 mmol/L ATP 52.49±1.00∗∗3.46±1.27∗∗3 mg/ml puerarin injec-tion+50 μmol/L ATP 440.28±7.44∗∗40.57±7.54∗∗

**P<0.01vs3 mg/ml puerarin injection group

2.4 氯通道阻断剂及激动剂药物自身不诱导红细胞溶血

为了观察Tamoxifen、ATP药物本身是否可引起红细胞溶血，实验同时设置单纯相应浓度药物的自身对照组。细胞图像记录系统观测发现(未显示)，与NS组相比，20 μmol/L Tam组、50 μmol/L ATP组、10 mmol/L ATP组红细胞数量和形态均无明显改变。酶标仪检测结果显示，20 μmol/L Tam组、50 μmol/L ATP组、10 mmol/L ATP组溶血率分别为(0.26±0.11)%、(0.27±0.16)%、(0.31±0.08)%，均与NS组(0.19±0.03)%溶血率无明显区别，差异无统计学意义(n=3，P> 0.05)。结果提示，实验中使用的氯通道阻断剂及激动剂自身对红细胞无明显影响，排除了药物本身诱导红细胞溶血的可能。

3 讨论

葛根素注射液主要成分为葛根素，是一种从中药葛根中分离得到的异黄酮类衍生物，其药理活性较为广泛，包括血管舒张、心脏保护、神经保护、抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及减弱胰岛素抵抗等。然而，葛根素注射液的急性血管内溶血等不良反应严重影响了其临床用药安全。

近来有文献报道，将膜稳定剂牛磺酸与葛根素注射液配伍使用，可一定程度上对抗葛根素注射液引起的红细胞形态异常和溶血反应[9]。生理状态下，牛磺酸是哺乳动物细胞内与渗透压调控密切相关的重要有机渗透物之一[10,11]。低渗溶液诱导细胞肿胀后，K+、Cl-等无机离子以及牛磺酸等有机渗透物可随之流出，同时伴随水的被动流出, 调节细胞容积，此机制被称为调节性容积减小(regulatory volume decrease，RVD)。我们及其他实验室的大量研究均证实，RVD过程中，细胞内Cl-、牛磺酸等溶质外流的主要机制为氯通道的激活[12-15]。那么，牛磺酸拮抗葛根素注射液溶血反应的机制是否和氯通道调控途径相关？氯通道在葛根素注射液致溶血反应中有何作用？

本研究首先在体外观察不同浓度葛根素注射液对家兔红细胞的作用。文献报道，葛根素注射液临床常用输液浓度约0.8 mg/ml，致溶血时最大输液浓度约3 mg/ml[16]，故本实验在0.75 mg/ml ～12 mg/ml范围内设置0.75、1.5、3、6、12 mg/ml共5个剂量。在实验所观察的剂量范围内，1.5 mg /ml葛根素注射液即可诱发一定程度的红细胞溶血，且效应随葛根素注射液浓度增加而增强，表现为浓度依赖性(图1、图2、表1)。鉴于我们之前的研究，20 μmol/L Tamoxifen、10 mmol/L ATP可阻断氯通道，而50 μmol/L ATP有激活氯通道的效应[17]，在本实验中我们观察这些氯通道阻断剂、激动剂对于临床致溶血剂量(3 mg/ml)葛根素注射液溶血效应的影响。使用氯通道阻断剂20 μmol/L Tamoxifen、10 mmol/L ATP关闭氯通道，可部分抑制3 mg/ml葛根素注射液诱导的红细胞溶血；而使用氯通道激动剂50 μmol/L ATP开放氯通道，则显著增强3 mg/ml葛根素注射液的溶血效应(图3、表 2)。这些结果提示，葛根素注射液致溶血作用与氯通道激活密切相关。实验中为了观察Tamoxifen、ATP两种药物本身是否可引起红细胞溶血，还同时设置了单纯相应浓度药物的自身对照组。结果显示，20 μmol/L Tamoxifen组、10 mmol/L ATP组、50 μmol/L ATP组与NS组相比红细胞溶血率无明显改变，基本排除这些药物本身诱导红细胞溶血反应的可能。由此我们推测，前述文献中提及的牛磺酸与葛根素注射液配伍使用，可能通过干预经由氯通道途径的牛磺酸跨膜转运过程，进而产生拮抗葛根素注射液溶血反应的效果。

综上所述，本研究结果表明葛根素注射液可诱导家兔红细胞体外溶血，作用呈浓度依赖性；氯通道激活与葛根素注射液诱导的溶血反应密切相关。然而，氯通道有囊性纤维跨膜电导调节体、钙激活性氯通道、电压门控氯通道、配体门控氯通道以及容积调节性氯通道等多种亚型[18]，何种类型的氯通道激活参与葛根素注射液诱导的溶血反应，其分子机制如何本研究尚未涉及，有待后续实验进一步探讨。