益气温阳活血化痰方对低氧高二氧化碳性肺动脉高压的作用及其机制*

张聪聪， 张晶晶， CHEN Jun-hao， 武垣伶， 黄丹娜， 戴雍月， 王万铁△

(1. 温州医科大学病理生理学教研室， 浙江 温州 325035； 2. 浙江医药高等专科学校药学院， 浙江 宁波 315100； 3. School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, Perth 6000, Australia)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一组能引起肺微血管结构重塑的疾病，导致肺血管阻力增加，最终引起右心衰竭，具有高致残率和死亡率[1-2]。PAH是一种常见病，用于描述与肺动脉压升高(静息时大于或等于25 mmHg，或运动时大于或等于30 mmHg)相关的恶性疾病[3]。近些年来，对PAH的相关研究大大增加了相关患者的生存时间和生活质量，缓解了疾病的进展[4]，然而未能完全突破和治愈PAH。研究表明，低氧高二氧化碳肺动脉高压(hypoxia-hypercarbia pulmonary hypertension, HHPH)的病理改变包括肺血管重塑，内皮细胞损伤，平滑肌细胞迁移增殖等[5]。

研究表明，内皮-间质转化(endothelial-mesenchymal transition, EndoMT)可能参与肺血管重塑过程，EndoMT的特点是细胞发生了形态、表型及功能的改变，内皮细胞特异性标志物如血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, CD31)表达减弱或消失，间质细胞特异性标志物如α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)表达增加[6-7]。近年来，PAH中EndoMT的发生机制研究备受关注，然而EndoMT的具体发生机制复杂，尚未完全明确。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是TGF-β超家族的一员，具有抑制纤维化的作用[8-9]，尤其是BMP-7(bone morphogenetic protein-7)及下游的Smads (drosophila mothers against decapentaplegic protein1/5/8)信号通路，但BMP-7/Smads通路是否抑制了HHPH的发展，目前尚未见报道。在中医领域里，肺动脉高压又称为肺胀，病理特征主要是本虚标实，其中本虚为气虚，标实为痰浊。针对这一病理机制，采用益气温阳活血化痰方(Yiqi Wenyang Huoxue Huatan Fang，YWHHF)，方药组成包括人参、黄芪、川芎、丹参、附片等。国内许多学者采用益气祛瘀化痰法治疗肺动脉高压症，能明显改善患者缺氧状况、临床症状，提高生活质量。本实验旨在探究YWHHF能否通过BMP-7/Smads通路抑制EndoMT从而缓解HHPH，为临床防治肺动脉高压症提供新的治疗思路及方法。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性健康清洁级SD大鼠50只，体重180 g～220 g，由温州医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK (浙)2015-0009。

1.2 试剂与药品

益气温阳活血化痰方(北京中医药大学组方)；BCA蛋白质浓度测定试剂盒、一抗稀释液(碧云天，中国)；兔抗大鼠α-SMA抗体、兔抗大鼠Smad1/5/8抗体、兔抗大鼠BMP-7抗体、小鼠抗大鼠CD31抗体(Abcam，英国)，兔抗大鼠Phospho-Smad1/5/8抗体(CellSignalingTechnology，美国)；逆转录试剂盒(Thermo公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG，山羊抗小鼠IgG(博蕴，中国)；脱脂奶粉(BD公司，美国)。

1.3 实验分组及模型制备

50只大鼠随机分为5组(n=10)：常氧组(N)、低氧高二氧化碳组(HH)，YWHHF高剂量组(YH)、中剂量组(YM)和低剂量组(YL)。N组置于常氧环境中饲养4周，其余四组在低氧高二氧化碳(9%～11%O2、5%～6%CO2)环境下暴露4周，每周6 日，8 h/日。YH、YM、YL组于进仓前灌胃等体积(3 ml/kg)不同浓度的YEHHF，按人--大鼠体表面积用药折算率进行转换，YH、YM、YL组大鼠用药量分别为0.6、0.3和0.15 g/kg，HH组于进仓前灌胃等体积生理盐水。

1.4 大鼠肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)检测

将大鼠称重，用10%水合氯醛麻醉大鼠，固定，酒精消毒大鼠颈部皮毛，分离皮下组织，暴露并提起颈外静脉，剪一“V”形切口，将连接压力换能器的PE导管沿切口往里推送，直至出现波形小而规则的肺动脉波，记录保存。

1.5 大鼠右心室肥大指数检测

测定mPAP后用生理盐水灌洗肺叶及心脏，直至呈现白色，剪下心脏放入PBS中，沿房室沟剪去心房及大血管根部，保留右心室游离壁(right ventricular free wall，RV)及左心室加心室间隔(left ventricle+ventricular septum，LV+S)，用滤纸吸干，称重，按公式算RV/(LV+S)，以此判定右心室肥大指数。

1.6 大鼠肺组织电镜观察

取1 mm×1 mm×1 mm大小的肺组织标本，将标本浸泡在电镜液中，随后用PBS漂洗，将标本浸入1%醋酸铀中2 h，依次用50%、70%、80%、90%丙酮脱水15 min，纯丙酮脱水20 min，用1∶1丙酮∶包埋液(V/V)=浸透，包埋，制片，透射电镜观察。

1.7 大鼠肺组织免疫荧光观察

将各组大鼠肺组织石蜡包埋，切片，60℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇依次水化5 min，PBS漂洗，3%双氧水孵育20 min，置于煮沸的0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中煮片4 min，5%BSA封闭，滴加兔抗大鼠α-SMA抗体和小鼠抗大鼠CD31抗体 (稀释比均为1∶100)，4℃过夜。次日37℃水浴复温45 min，PBS冲洗，滴加荧光标记二抗，37℃水浴孵育30 min，50%甘油封片，荧光显微镜观察并拍片。

1.8 RT-PCR检测α-SMA、CD31、BMP-7、Smad1/5/ 8 mRNA表达水平

取大鼠肺组织加液氮在研钵中研磨，用Trizol法提取总RNA，测定RNA浓度后用逆转录试剂盒合成cDNA并扩增。PCR参数：预变性：95℃，6 min；变性：95℃，1 min；退火：α-SMA(53.9℃)、CD31(51.2℃)、BMP-7(52.8 ℃)、Smad1/5/8(59.5 ℃)、β-actin(54℃),30s；延伸：72℃，1 min，32个循环；终止延伸：72℃，5 min。以β-actin为参照物，实验结果用Quantity One分析，具体引物序列见表1。

Tab. 1 Primer sequence

1.9 Western-blot测定α-SMA、CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8的蛋白质表达水平

取100 mg大鼠肺组织加液氨在冰上充分研磨，加1 000 μl RIPA(含10 μl PMSF)裂解组织，4℃离心后取上清，BCA法测定蛋白质浓度。进行PAGE并转膜，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，TBST漂洗3次，滴加兔抗大鼠α-SMA抗体、小鼠抗大鼠CD31抗体、兔抗大鼠BMP-7抗体、兔抗大鼠Smad1/5/8抗体、兔抗大鼠p-Smad1/5/8抗体(均为1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次，用山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(1∶10 000稀释)室温孵育1 h。TBST洗膜3次，加曝光液置于曝光仪曝光，用Quantity One软件分析结果，以目的蛋白质与GAPDH蛋白质灰度值之比表示目的蛋白质的表达水平，以p-Smad1/5/8与Smad1/5/8的比值反映Smad1/5/8磷酸化水平的变化。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠肺动脉平均压及右心室肥大指数的比较

4周后与N组大鼠比较，其余四组造模大鼠mPAP均不同程度地升高(P<0.01)，RV/(LV+S)比值均呈不同程度增大(P<0.01)；与HH组大鼠比较，YH组、YM组及YL组mPAP均有不同程度降低(P<0.01)，YH组和YM组的RV/(LV+S)也呈降低趋势(P<0.01)，YL组RV/(LV+S)变化无统计学意义(P>0.05)；与YL组大鼠比较，YM组mPAP呈降低趋势(P<0.05)，YH组mPAP变化无统计学意义(P>0.05)，YH组和YM组右心室肥大指数均相应减少(P<0.05，表2)。

GroupmPAP(mmHg)RV/(LV+S)(%)N15.82±1.4624.54±1.94HH29.54±3.14∗∗33.43±2.56∗∗YH21.40±2.48∗∗△△28.58±2.40∗∗△△#YM20.15±3.10∗∗△△#28.49±2.41∗∗△△#YL23.09±3.36∗∗△△31.33±2.53∗∗

N: Normoxia group; HH: Hypoxia-hypercarbia group; YH: Yiqi Wenyang Huoxue Huatan Fang (YWHHF) high dose group; YM: YWHHF middle dose group; YL: YWHHF low dose group

**P<0.01vsN group;△△P<0.01vsHH group；#P<0.05vsYL group

2.2 各组大鼠肺组织的电镜观察结果的比较

与N组相比，其余四组大鼠肺动脉内皮细胞出现不同程度的脱落坏死，平滑肌细胞胞质肿胀明显，胶原纤维簇集增生；与HH组相比，YH、YM、YL组大鼠内皮细胞脱落坏死情况改善，平滑肌细胞胞质肿胀不明显，可见少量胶原纤维簇集(图1)。

2.3 各组大鼠肺动脉壁CD31和α-SMA表达水平的比较

CD31是内皮细胞的特异性标志物，常分布于血管内膜，呈绿色荧光；α-SMA是平滑肌细胞的标志物，常分布于血管中膜，呈红色荧光。实验结果显示：与N组比较，其余四组CD31脱落明显，绿色荧光强度减弱，α-SMA分布弥散；与HH组比，YH、YM、YL组CD31荧光强度增强，α-SMA在血管中膜分布，荧光强度一般(图2，见彩图页Ⅴ)。

Fig.1The observation of histomorphology of lung tissue in each group by electron microscope(×5 000)

N: Normoxia group; HH: Hypoxia-hypercarbia group; YH: Yiqi Wenyang Huoxue Huatan Fang(YWHHF)high dose group; YM: YWHHF middle dose group; YL: YWHHF low dose group

2.4 各组大鼠肺组织α-SMA、CD31、BMP-7、Smad1/5/8 mRNA相对表达量的比较

与N组比较，其余四组CD31、BMP-7、Smad1/5/8 mRNA表达水平均明显降低(P<0.01)， α-SMA mRNA表达水平明显升高(P<0.01)；与HH组比较，YM组、YH组和YL组CD31、BMP-7、Smad1/5/8 mRNA水平有不同程度的升高(P< 0.01，P<0.05)，α-SMA水平明显降低(P<0.01)；与YL组比较，YM组、YH组BMP-7 mRNA水平均有不同程度升高(P<0.01，P<0.05)，α-SMA mRNA水平降低(P<0.05)，CD31和Smad1/5/8 mRNA无明显影响(P>0.05，表3，图3)。

2.5 各组大鼠肺组织α-SMA、CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8和Smad1/5/8蛋白质表达水平的比较

与N组比较，其余四组CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8蛋白质水平均明显降低(P<0.01，P<0.05)，α-SMA水平明显升高(P<0.01，P<0.05)；与HH组比，YM组、YH组和YL组CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8蛋白质水平有不同程度的升高(P<0.01，P< 0.05)，α-SMA水平明显降低(P<0.05)；与YL组比较，YM组、YH组CD31、BMP-7蛋白质表达水平均有不同程度升高(P<0.05)，α-SMA蛋白质表达水平明显降低(P<0.05，表4，图4)。

3 讨论

PAH是一类目前尚未明确具体病因机制的进行性疾病，其病理改变包括肺血管收缩反应，肺血管重构，持续肺动脉压力升高，右心室肥大等[10-12]。

A: α-SMA mRNA expression in each group; B: CD31 mRNA expression in each group; C: BMP-7mRNA expression in each group; D: Smad1/5/8mRNA expression in each group; N: Normoxia group; HH: Hypoxia-hypercarbia group; YH: YWHHF high dose group; YM: YWHHF middle dose group; YL: YWHHF low dose group

**P<0.01vsN group；△P<0.05,△△P<0.01vsHH group；#P<0.05,##P<0.01vsYL group

A: α-SMA protein expression in each group; B: CD31 protein expression in each group; C: BMP-7protein expression in each group; D: p-Smad1/5/8 and Smad1/5/8 protein expression in each group; N: Normoxia group, HH: Hypoxia-hypercarbia group; YH: YWHHF high dose group; YM: YWHHF middle dose group; YL: YWHHF low dose group

*P<0.05,**P<0.01vsN group；△P<0.05,△△P<0.01vsHH group；#P<0.05vsYL group

Tab. 3 α-SMA、CD31、BMP-7、Smad1/5/8 mRNA expression in each group n=10)

**P<0.01vsN group；△P<0.05,△△P<0.01vsHH group；#P<0.05,##P<0.01vsYL group

Tab. 4 α-SMA、CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8 protein expression in each group n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsN group；△P<0.05,△△P<0.01vsHH group；#P<0.05vsYL group

PAH预后不佳，且增加患者与国家的经济负担，因此控制PAH的发生发展对提高人民生活质量有极大的作用[13]。PAH与肺血管重构相关，更常继发于房间隔缺损[14]、慢性阻塞性肺疾病(COPD)[15]、间质性肺纤维化和相关心脏病[16]等。近年来，尽管对PAH的生物遗传学[17]，炎症[18]等发病机制的研究有重大进展，但仍未能完全突破和治愈PAH。研究表明，从转分化角度研究肺血管重构可能会有所突破[19]。由于在PAH发生的同时可在很大程度引起机体二氧化碳潴留，因此制备吸入O2和CO2混合气体的肺动脉高压动物模型更符合肺心病人群发病的情况[20]。

EndoMT是一种细胞表型转化，血管内皮细胞具有产生肌成纤维细胞特征的能力，其特征在于血管内皮标志物如CD31、血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)等下调，肌成纤维细胞标志物如α-SMA、纤维母细胞特异蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)等的出现[21]。目前认为TGF-β家族对EndoMT的产生与发展起着重要的作用，BMP-7是TGF-β超家族的成员，BMP-7能与BMP II型受体结合并磷酸化I型受体，磷酸化的I型受体作用于下游的Smad1/5/8并使后者磷酸化，随后p-Smad1/5/8与Smad4结合成复合体，移位至细胞核，调控相应的靶因子显示出抗纤维化作用，抵消TGF-β使Smad2/3磷酸化的作用。已有研究表明，BMP-7能抑制心脏纤维化小鼠模型中EndoMT的作用[22-23]。

肺胀辨证总体属于本虚标实，肺位于胸部的中央，通过鼻与外界相连。肺气缺少或亏虚，早期多因外邪侵犯或个体自身失调所致；长期患病易导致咳喘，运动时加重，损耗气血，累及肾、脾等器官。肺气亏虚，则运动功能和呼吸功能较常人明显降低，表现为咳嗽、咳痰无力，气不足，乏力等；肾气亏虚表现为视物不清，耳鸣，腰酸腿疼，食欲差等[24]。外因和内因均可导致肺气损伤，肺气上逆并瘀结、肺部胀满、呼吸困难，导致喘促，体内外换气功能失调，清气进入体内有阻碍，浊气不能顺利排出体外，导致痰浊、水饮和血瘀等症状。中医学认为[25]，人体的痰随着身体的气血运行，经过五脏六腑和脉络，由痰逐渐生成瘀，最终影响身体的血运，因此肺胀患者常常合并有痰浊和血瘀。有鉴于此，经过长期临床实践，采用益气温阳活血化痰的药物治疗取得显著的效果。全方组成主要有：黄芪30g、人参20 g、附片9 g、川芎10 g、丹参10 g、法夏9 g、薤白12 g、白芥子15 g，但YWHHF对HHPH是否有作用目前尚不明确。YWHHF中的人参补脾益肺，黄芪益气通血，川芎和丹参活血之效显著，能使百脉畅通，附片和薤白等具有化痰活瘀之效。本实验按体表面积将人体用量折算成大鼠等效剂量，再将YWHHF分为高、中、低三个剂量组，浓度分别为0.6 g/kg，0.3 g/kg和0.15 g/kg。研究结果表明，正常组大鼠活动状态、饮食饮水正常，而造模组大鼠明显烦躁不安，对轻微刺激即表现出过度反应，与N组比，CD31、BMP-7、Smad1/5/8的mRNA下降，CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8的蛋白质水平亦降低，平滑肌标志物α-SMA的mRNA和蛋白质水平、mPAP和右心室肥大指数上升，电镜下肺血管有不同程度损伤，免疫荧光检测显示内皮细胞有减少趋势，同时平滑肌细胞增生明显，提示低氧高二氧化碳能引起EndoMT，并造成一定程度的肺血管重构，从而产生肺动脉高压。与HH组比，YH、YM、YL组CD31、BMP-7、Smad1/5/8的mRNA上升，CD31、BMP-7、p-Smad1/5/8的蛋白质水平亦上升，α-SMA的mRNA和蛋白质水平、mPAP和右心室肥大指数下降，电镜下肺血管损伤有所减轻，免疫荧光检测显示内皮细胞向平滑肌细胞转化不明显，提示YWHHF能减低肺动脉压力，在一定程度上逆转低氧高二氧化碳导致的肺血管重构，其机制可能与促进BMP-7/Smads通路的表达有关。综合药效、经济等各方面考虑，以0.3 g/kg的中剂量更具有推广意义。

综上所述，YWHHF可缓解HHPH并降低肺动脉压力，其机制可能是促进BMP-7/Smads通路的表达从而抑制EndoMT。