生姜泻心汤对CT26荷瘤小鼠伊立替康相关毒性的防治作用研究

吴梦雨，邓 博，贾立群⋆

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院 中西医结合肿瘤科，北京 100029）

伊立替康（Irinotecan，CPT-11）是半合成喜树碱衍生物，在体内经羧酸酯酶转化为7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38），通过抑制DNA 单链断裂后的修复，干扰DNA 的复制和转录，发挥细胞毒作用，被广泛应用于晚期结直肠癌、胃癌、胰腺癌患者[1]。但其剂量限制性毒性尤其是迟发性腹泻和中性粒细胞减少症严重影响患者生存质量，甚至威胁生命。目前西医对伊立替康所致迟发性腹泻尚无明确有效的标准治疗手段，而多项临床观察和动物实验均已证实生姜泻心汤等中药经方以其多靶点的特性对CPT-11 导致的腹泻具有明显预防作用。本研究旨在对生姜泻心汤防治荷瘤小鼠CPT-11 所致迟发性腹泻和中性粒细胞减少症的疗效进行观察，并对其作用靶点和机制做进一步的研究，为中药预防化疗相关毒性提供科学依据。

1 实验材料和方法

1.1 动物和细胞

健康雌性BALB/c 小鼠，6 周龄，体重18～20g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[合格证号：SCXK（京）2010-0001]，饲养于中日友好医院临床医学研究所动物室（SPF 级）；BALB/c 小鼠来源的CT-26 结肠癌细胞，引自中日友好医院临床医学研究所。

1.2 药物与试剂

盐酸伊立替康注射液（Pfizer 公司，批号：R99183）； 肿 瘤 坏 死 因 子-αELISA 试 剂 盒（e-Bioscince 公司，批号：20180123）、IL-10 ELISA 试剂盒（eBioscience 公司，批号：20180217）；苏木素伊红染色液（中日友好医院临床医学研究所）；瑞氏染色液（中日友好医院临床医学研究所）；中药（生姜泻心汤）：生姜12g、半夏9g、党参9g、黄芩9g、干姜3g、黄连3g、甘草9g、大枣12g，购于中日友好医院中药房，水煎，浓缩至2g/ml。

1.3 方法

1.3.1 荷瘤小鼠模型的制备及分组

复苏CT26 细胞，以5×106个/只接种于小鼠背部，7～10d 后形成肿瘤。取肿瘤生长旺盛且无溃破的动物，脱颈处死后消毒操作部位皮肤然后切开，选择生长良好的瘤组织置于无菌平皿内，将肿瘤组织剪成2～3mm3的小块，用无菌玻璃研磨，磨匀后装入无菌容器内，加生理盐水稀释1：3～1：4的瘤细胞悬液，经0.4%台盼蓝染色镜检细胞存活率≥95%后，接种于小鼠颈背部每只0.2ml（约5×106个）。待瘤体生长约100mm3随机分为3 组，每组6 只，分别为对照组、模型组、生姜泻心汤组。

1.3.2 迟发性腹泻模型的建立及给药方案

正常组腹腔注射生理盐水，生姜泻心汤组和模型组参考Lam W[2]方法造模，CPT-11 350mg/kg腹腔注射，生姜泻心汤组小鼠在CPT-11 给药前3d 予生姜泻心汤10g/kg 灌胃，连续8d，模型组和对照组灌胃等量生理盐水。

表1 小鼠腹泻评分标准

1.3.3 标本采集

各组小鼠末次给药后禁食12h，摘眼球取血，制备血涂片。然后取空肠、回肠、盲肠、结肠各2～3cm 以及肝脏。用于做病理学检测的标本置于中性福尔马林中固定48h；剩余标本保存于-80℃冰箱中备用。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 小鼠一般生活状态观察

给药期间每天观察小鼠的一般状况（精神状态、毛发色泽、反应性等），测量小鼠体重、进食量。

1.4.2 腹泻评分

注射伊立替康后每天将小鼠置于代谢笼正常饲养，下面铺有滤纸以观察大便情况。评分标准：参照Akinobu Kurita 的方法[3]，具体见表1。

1.4.3 中性粒细胞计数

小鼠取全血，滴在清洁载玻片上，立刻进行血涂片，使用瑞氏-吉姆萨染液染色法检测中性粒细胞，光学显微镜下计数并取10 个视野下平均值，记录并比较各组中性粒细胞数。

1.4.4 小鼠结肠组织病理形态学观察

小鼠结肠组织经福尔马林固定、脱水、石蜡包埋后进行3μm 切片，采用HE 染色法，在光学显微镜下观察小鼠肠粘膜的病理形态学改变。

1.4.5 结肠TNF-α 和IL-10 检测

取结肠组织，称定质量，用9 倍生理盐水匀浆，以3000r/min 的速率离心10min，得到肠组织匀浆上清，分离上清液，置无菌EP 管中，进行酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测，检测方法和步骤严格按照试剂盒附件说明书进行。

1.5 统计学方法

应用SPSS17.0 软件进行统计学分析。计量资料采用方差分析进行组间比较，等级资料采用秩和检验进行分析。

2 结果

2.1 小鼠的一般状态

对照组小鼠一般状态良好，进食、饮水均正常，背部肿瘤增长迅速，行动稍迟缓，皮毛有光泽，肛门干燥，无红肿；模型组小鼠注射化疗药后开始出现明显的消瘦，活动、进食减少，弓背蜷缩、聚集角落、精神萎靡，皮毛污秽，肛门湿润红肿；生姜泻心汤组小鼠状态较模型组有所改善，部分出现毛发竖立、光泽下降，倦怠乏力等症状。如图1所示，生姜泻心汤改善了小鼠伊立替康化疗后出现的体重下降。实验d5 开始，模型组和生姜泻心汤组小鼠体重开始降低，分别于d8 和d7 达到最低值，而后开始增长；从实验d7 起，生姜泻心汤组小鼠体重显著高于模型组（P＜0.05）。

图1 各组小鼠体重变化（g）

表2 各组小鼠腹泻评分变化（±s）

表2 各组小鼠腹泻评分变化（±s）

注：* 与对照组比较，P＜0.05，** 与对照组比较，P＜0.01，△与模型组比较，P＜0.05，△△与模型组比较，P＜0.01。

组别 d5 d6 d7 d8对照组 0 0 0 0模型组 2.17±0.41 2.5±0.55 2.67±0.52 2.5±0.55生姜泻心汤组 1.67±0.82** 1.5±0.55**△△ 1.5±0.55**△△ 1.33±0.52**△△

2.2 小鼠的腹泻评分

注射伊立替康24h 后，模型组和生姜泻心汤组小鼠分别出现不同程度的腹泻，对照组大便正常，呈干燥颗粒状，肛门干燥无红肿。模型组小鼠给药后腹泻率达100%，肛周皮肤黏膜红肿，大便湿软不成形，部分呈水样便。生姜泻心汤组大便微湿软，部分大便不成形，肛周湿润微红肿。模型组腹泻评分均高于其他2 组（P＜0.05），而生姜泻心汤组小鼠腹泻评分较模型组显著下降（P＜0.05）。

2.3 小鼠的中性粒细胞计数

模型组小鼠全血中性粒细胞数（1.83±0.75）个/视野，显著低于对照组（5.67±0.82）个/视野（P＜0.01）。生姜泻心汤组中性粒细胞数（4.83±0.75）个/视野与模型组相比显著升高（P＜0.01），说明生姜泻心汤能有效缓解小鼠因伊立替康化疗所致的中性粒细胞减少症。

表3 各组小鼠结肠TNF-α、IL-10 水平（±s）

表3 各组小鼠结肠TNF-α、IL-10 水平（±s）

注：与对照组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 TNF-α IL-10对照组 30.28±11.9 80.05±10.37模型组 94.73±21.27** 22.06±8.48**生姜泻心汤组 62.33±16.69**△△ 56.58±12.17**△△

2.4 小鼠结肠组织病理形态学观察

图2（见封二）示，对照组小鼠肠黏膜完整，腺体排列整齐，结构清晰，无水肿、充血及组织坏死，固有层内未见炎症细胞浸润；模型组肠黏膜肿胀，腺体结构不规则，大量隐窝结构破坏和绒毛缩短或脱失，黏膜下水肿、充血及炎性细胞浸润；生姜泻心汤组可见肠绒毛形状较完整、黏膜排列规整，少量炎性细胞浸润。

2.5 生姜泻心汤对小鼠结肠TNF-α、IL-10 水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠结肠组织TNF-α含量显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，生姜泻心汤组TNF-α 含量显著降低（P＜0.01）。与对照组比较，模型组小鼠结肠组织IL-10 含量显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，生姜泻心汤组IL-10 含量显著增高（P＜0.01）。

3 讨论

近年来研究表明[4，5]，伊立替康的活性代谢产物SN-38 是引起肠黏膜损伤、导致腹泻的主要原因。CPT-11 在肝内羧酸酯酶的作用下转化为SN-38，其细胞毒性是伊立替康的100～1000 倍，随胆汁排泄至肠腔，重吸收时对肠上皮造成损伤，引起肠黏膜炎，导致肠道菌群移位，加剧腹泻的发生，并能进一步通过肠道菌群对氨基酸、胆汁酸等代谢造成影响。

迟发性腹泻是指伊立替康化疗后24h 之后出现的腹泻，一般表现为大便次数增多、出现软便或稀便或水样便，伴有腹痛、腹部胀气、乏力等[6]。根据迟发性腹泻的表现，该病属于中医“泄泻”、“下利”范畴。《景岳全书·泄泻》云：“泄泻之本，无不由于脾胃。”肿瘤患者素体正气虚弱，加之化疗药物伊立替康为外来药毒，使肿瘤患者脾胃功能更加虚损，脾胃运化失司，致使脾不升清，胃不降浊，水谷不化，生湿化热，湿热邪毒流注大肠而生腹泻。因此化疗所致迟发性腹泻以脾虚湿盛为基本病机，多属本虚标实之证，主要病位在肠，治疗以健脾、化湿为主。临床上伊立替康引起腹泻的同时，常伴随类似腹部痞满不适的症状，属中医“痞证”范畴，与脾胃升降失调，中焦气机紊乱相关。泻心汤类方主治“心下痞”证，可能是通过调整脾胃气机，改善胃肠功能实现。

国内外研究发现[7，8]，半夏泻心汤可有效改善CPT-11 所致腹泻，可能通过其中成分黄芩苷对细菌β-葡萄糖醛酸酶的抑制作用，减少肠道SN-38的累积而减少腹泻的发生，或通过升高血清中IL-15 的水平，抑制炎症反应，从而减轻腹泻症状。生姜泻心汤由半夏泻心汤减干姜二两加生姜四两而成，同属泻心汤类方，组方攻补兼施、寒热平调，减轻了燥热之性，增强了散水气之力。既往研究[9，10]表明，生姜泻心汤可通过上调大鼠肠黏膜CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞及SIgA 的表达，保护肠黏膜免疫屏障，抑制肠道细胞凋亡并促进肠道干细胞增殖，从而改善肠黏膜损伤程度，对CPT-11所致的迟发性腹泻有一定预防作用。而其对荷瘤模型和血液毒性影响的研究却鲜有报道。故本实验欲探究生姜泻心汤对结肠癌小鼠迟发性腹泻的防治作用，并观察其对伊立替康血液毒性的影响。

本实验在成功复制伊立替康迟发性腹泻荷瘤小鼠的基础上，观察到中药生姜泻心汤组小鼠给药后，腹泻次数减少，腹泻评分较模型组明显降低（P＜0.05）；CPT-11 化疗后小鼠各段肠粘膜结构均有不同程度的损伤，且盲肠、结肠损伤更重，而生姜泻心汤组小鼠肠道结构尚完整，绒毛和肠腺结构损伤较模型组改善； 生姜泻心汤能降低小鼠TNF-α、升高IL-10 水平，并能有效缓解中性粒细胞减少症。

TNF-α 主要由巨噬细胞产生，是调节炎症反应的关键因子，能诱导细胞因子的分泌，提高巨噬细胞的吞噬能力[11]；IL-10 是由Th2 淋巴细胞分泌的一种活性物质，可抑制Th1 细胞的激活以及T细胞和NK 细胞分泌的细胞因子，从而达到限制炎症反应的作用[12]。有研究报道[13]，IL-10 缺陷小鼠可自发结肠炎和其他扩大性炎症反应，且IL-10 基因敲除小鼠是国际公认的克罗恩病小鼠模型，说明IL-10 在维持肠道黏膜免疫功能调节中发挥重要的作用。而生姜泻心汤中的芍药有养血柔肝、缓急止痛之功，芍药苷能够升高IL-10 的表达、下调促炎因子的表达，从而调节肠道免疫反应，修复溃疡性结肠炎大鼠肠组织溃疡[14]。甘草的重要活性成分甘草酸苷，是高迁移率族蛋白-1 的天然抑制剂，其抗炎作用越来越受到关注，在感染、烧伤、胰腺炎和溃疡性结肠炎等炎性疾病中发挥治疗作用[15]。生姜泻心汤对伊立替康血液毒性的影响，可能与其中的补益药党参有关。一项对42 例化疗所致白细胞减少、造血功能障碍和贫血患者治疗的临床观察显示，党参治疗的总有效率为90.48%[16]。

综上所述，生姜泻心汤可能通过降低肠道促炎因子和升高抑炎因子水平，调整机体的免疫状态、抑制炎症反应，从而减轻对肠粘膜的损伤，维持肠道正常结构和功能，预防迟发性腹泻的发生，还可缓解中性粒细胞减少症。但其对肿瘤组织和CPT-11 血液毒性的影响的作用机制值得进一步探究。