多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其系统进化分析

曹瑞勇,张振兴,聂 鑫,李宝宝,黄海峰,杨小健,朱 姝,杜 丽,王凤阳

(海南大学 海南省热带动物繁育与疫病研究重点试验室 海口市动物基因工程重点试验室,海南 海口 570228)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida,PM)是革兰阴性球杆菌,无运动性、兼性厌氧,属于巴氏杆菌属中最重要的畜禽致病菌。该菌宿主广泛,不同动物之间可以相互传染。人被患病动物咬伤或抓伤时易感染该菌,引发皮肤炎症。动物机体免疫力低下时,可以引发多种以传染性肺炎和败血症为主的疾病,如禽霍乱、猪肺疫、猪进行性萎缩性鼻炎、牛出血性败血症、兔鼻漏等[1]。哺乳羔羊更易感染多杀性巴氏杆菌,造成突发症状,患病羊畏冷战栗、体质虚弱、呼吸困难,数分钟至数小时内死亡[2]。多杀性巴氏杆菌可以引起多种动物的疾病,给养殖业造成了巨大的经济损失。

海口市某黑山羊场,多只羔羊出现精神萎靡、呼吸困难、后期出现水样腹泻等症状,患病严重的羔羊最终常因为腹泻虚脱而死。本试验采集多只患病羊羔的心脏、肺脏、肝脏进行致病菌的分离培养。并通过细菌形态学观察、生化反应试验、多重PCR和荚膜血清型分型PCR技术最终确诊该病致病菌为D型多杀性巴氏杆菌。本试验对菌株进行毒力因子分析、药敏试验和系统进化树的构建,旨在为多杀性巴氏杆菌引起的黑山羊疾病的治疗提供了参考。

1 材料与方法

1.1 病料和实验动物 海南省海口市某黑山羊养殖场发病羔羊的心脏、脾脏及肝脏。SPF级KM小鼠,购自海南省药物研究所,使用许可证号SCXK(琼)2015-0007。

1.2 主要试验材料 TSA、TSB培养基,购自美国BD公司;麦康凯培养基,购自广东环凯生物有限公司;脑心浸液(BHI),购自北京陆桥生物技术有限责任公司;麦康凯琼脂培养基、药敏试纸,购自杭州天和微生物试剂有限公司;生化鉴定管,购自杭州天合生物有限公司。

1.3 引物合成和设计 参照崔颖鹏[3]合成细菌16S rRNA通用引物,参照Townsend等人[4]合成多杀性巴氏杆菌分型引物、毒力因子引物,送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 细菌的分离鉴定将1～2 g采集肺脏等组织研磨处理,溶于1.5 mL离心管中,离心取上清,涂布于5%绵羊脱纤维血平板(TSAB)上和麦康凯(MAC)培养基上,37℃培养18 h,对染色形态统一的菌落进行生化性质的分析测定。

1.5 细菌 16S rRNA序列分析、细菌分型和毒力基因检测 PCR反应扩增反应体系(50 μL)：2×Premix Taq Buffer 25 μL,上游引物和下游引物各2 μL,灭菌水补足到50 μL[5]。 观察结果,PCR 产物经回收纯化送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 分离株生化反应鉴定 参考说明书接种于生化鉴定管中[6],观察并记录反应结果。

1.7 毒力因子检测 用多杀巴氏杆菌D型的毒力基因引物,PCR反应,利用2%的琼脂糖进行凝胶电泳,检测扩增结果。

1.8 攻毒试验 将20只健康KM雄性小鼠,随机分为4组,每组6只,试验组分别腹腔注射菌数为1、0.1、0.01亿的菌,空白对照组注射等体积的PBS[7],观察小鼠发病情况。取攻毒致死的小鼠和健康小鼠肺脏,制作为石蜡组织切片,进行H.E染色(图2)。

1.9 药物敏感试验 按K-B纸片扩散法[8],将左氧氟沙星、庆大霉素、四环素等9种常用抗菌药物的药敏纸片放在含有5%胎牛血清的TSA平板上培养。记录耐药情况。

1.10 细菌16S rRNA进化树分析 根据BLAST比对结果,选取不同地区的多杀性巴氏杆菌16S rRNA序列进行系统发育树分析。利用Notepad++处理序列,利用MEGA6软件中最大可能性法构建系统进化树。

2 结果

2.1 分离菌株革兰染色 将分离的菌株进行革兰染色,油镜下观察,结果显示,单一阴性球杆菌。

2.2 细菌16S rRNA测序结果及分析 对分离得到的单一菌落进行细菌16S rRNA PCR扩增,经1%凝胶电泳分析,发现确有1条大小为1 495 bp目的条带,结果见图1。对测序结果进行BLAST分析后发现,分离得到菌株和GenBank上公布的LT906458.1同源率为99%。

图1 分离菌株16S rRNA PCR产物

2.3 毒力因子检测结果 根据多杀性巴氏杆菌各毒力因子的序列,分别利用不同的特异引物进行毒力因子检测,经2%琼脂糖凝胶电泳检测表明,存在tonB和tonA毒力因子,不存在ptfA毒力因子。结果见图2。

2.4 多杀性巴氏杆菌分型结果 利用巴氏杆菌特异性分型引物进行PCR反应,经2%琼脂糖凝胶电泳检测,该菌株为D型多杀性巴氏杆菌结果见图3。

2.5 生化反应鉴定结果 严格按照生化反应试剂盒操作规范对该多杀性巴氏杆菌进行生化鉴定试验。结果见表1。

图2 毒力因子扩增结果

图3 多杀性巴氏杆菌分型结果

2.6 小鼠攻毒试验,阴性小鼠,状态良好。阳性小鼠全部死亡。经革兰染色和多杀性巴氏杆菌特异引物鉴定,确定为致病菌。病理组织切片显示,肺泡间隔血管充血,肺泡中有大量浆液及纤维素和红细胞以及嗜中性粒细胞,结果见封三彩版图4。

2.7 药敏试验结果 该菌对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、四环素、庆大霉素、阿莫西林敏感;对头孢他啶、红霉素中敏,对氟苯尼考耐药。

表1 生化鉴定试验结果

2.8 系统进化分析结果 对该分离菌株的16S-rRNA序列及选取的其他地区和国外的多杀性巴氏杆菌的16S rRNA序列使用MEGA 6.0软件中Maximum Likelihood methods成功构建出有根的、基于单个同源基因差异的系统进化树,见图5。结果发现,该菌株和中国河北、湖北、重庆等地分离菌株的亲缘关系较近,和美国、英国、印度等地的分离菌株进化亲缘关系较远。

3 讨论

多杀性巴氏杆菌普遍存在于多种动物的上呼吸道内,是一种机会致病菌,根据荚膜型分为5种,分别是 A、B、D、E、F型,血清型分类为 1 ～16型[9]。据报道多杀性巴氏杆菌B型明矾沉淀疫苗对牛羊有6个月的保护,但目前其他型的长期高效的疫苗尚在研发[10],需及时对病死羊消毒和无害化处理,能较好控制该病扩大感染范围。

本试验分离得到的多杀性巴氏杆菌对生长条件的要求比较苛刻,在血平板上生长良好,麦康凯培养基上不生长,普通琼脂培养基生长贫瘠。该菌落形态一致,呈淡黄色边缘光滑的无溶血环样。根据构建的进化树可知,该菌株和中国河北、湖北、重庆等地分离菌株的亲缘关系较近,和美国、英国、印度等地的分离菌株进化亲缘关系较远,符合疾病流行传播的规律,说明该型菌在我国较为统一。

图5 多杀性巴氏杆菌进化树建立