兽用疫苗生产中支原体的检测方法

王淑梅

（黑龙江省拜泉县三道镇畜牧综合站，黑龙江 拜泉 164700）

兽用生物制品使用的生产中培养细胞，如果被支原体污染，则会对制品的质量和安全性造成比较大的负面影响，同时会在经济方面造成比较严重的损失。所以，在实际生产中应该掌握对支原体污染的检测方法，及相关的衍生技术确保兽用生物制品的质量与安全。

目前，已知自然界中存在的类微生物远超过100种，而这些微生物都会直接或间接对人类和动物造成感染。

据相关的试验结果可知，支原体对国内采用的普通疫苗和细胞生产活毒疫苗造成了比较严重的污染，给生物制药企业造成非常大的经济压力，同时也不利于畜禽疾病防控工作的顺利开展。相关规定中注明所有细胞生产的活疫苗不检测到支原体，所以就要求相关的技术人员熟练掌握支原体的检测技术，以保证生物制品生产工作顺利开展。

1 支原体的检测

1.1 传统检测法

（1）直接培养法：我国的相关准则中明确规定，直接培养法是支原体检测的标准方法。主要是将待检样品接种到支原体培养基上，对液体培养基的颜色和固体培养基上支原体菌落的变化进行观察，然后通过正确的判断给出试验结果，这种方法的准确率比较高，但是培养的时间却比较长，同一个培养基中所有的支原体类型并不能全部的检测出来，所以这种检测方法一般应用于种毒和成品的检测。

（2）DNA荧光染色法：此种方法也被称为指示细胞法，此种检测方法的耗时比较短，能够同时对多个样品进行检测，对采用培养法不能检测出的支原体给予正确的检测，如果有条件在配制疫苗之前就进行初步的检测，将其中不合格的样品去除掉，这样既能避免相应的损失，又能有效保证对疫苗的质量。

1.2 血清学法

（1）被动颗粒凝集试验(PPA)：可应用于细菌、支原体的鉴定和抗体的定性检测。我国相关的专家用此方式对肺炎支原体进行检测，结果可知被动凝集法的操作比较简单，但是却具有比较高的精确性和敏感度，在实际的临床生产中可以更有效的应用。

（2）酶联免疫吸附试验(ELISA)：医学界至今为止，用此种方法是诊断人和动物肺炎支原体实用和可靠的方法之一。本检测方法操作简单并且特异性和敏感性都比较佳，目前已经被广泛应用于临床兽医学领域，并且成为检测肺炎支原体的在临床中的常规方法。

1.3 分子生物学技术

（1）PCR检测技术：支原体通常生长都比较缓慢并且对营养环境的要求相对比较高，并且在种间存在交叉抗原等生物学特性。随着相关领域研究人员逐渐深入对支原体的核酸结构、分子组成及其特异性的了解，国际上就已经在支原体的检测中融入了PCR技术技术，在特异性和灵敏性方面有更佳的表现，并且在兽用生物制品的生产中进行了广泛的推广和应用，但是此种方法对试验环境和仪器的要求标准相对比较高，所以很容易出现交叉污染的情况，生产中必须给予足够的重视。

（2）巢式PCR检测法：基于PCR检测方法加以优化改进，主要是通过设计巢式PCR引物的方式，根据扩增后是否存在目的片段的情况对具体的污染状况加以比较合理且正确的判断，然后还要再根据存在片段的大小情况，对污染的支原体类型进行正确的判断分析，从而将污染源进行准确的判断。

（3）实时荧光定量PCR技术：最初是早在1996年的美国某家公司第一次推出了实时荧光定量PCR检测技术。现在，在动物营养与繁殖、动物遗传育种及动物疾病检测和预防等领域已经都有了实时荧光定量PCR技术的应用，但是在实际的应用中，在应用方面没有达到特别广泛的范围，从而受到了一定的限制，应用时应该给予一定的重视。

（4）DNA分子杂交检查法：原核生物的rRNA是高度保守的。采用这种检测方法具有特异性高的特点，可大致的鉴别出污染支原体的种类。

2 相关的防治

目前已知自然界中有多于120种的支原体存在，在生物制品生产中，感染支原体的组织细胞会在不同程度上改变细胞形态和遗传物质，从而对病毒的复制过程产生一定的影响，同时会在不同程度上改变宿主细胞的免疫能力，从而诱导干扰素的产生。所以在兽用疫苗生产过程中，尤其是将培养细胞作为材料的疫苗生产情况，应该对支原体的预防加以重视，决不能忽视。保持细胞营养液呈酸性，可以抑制支原体的生长，避免支原体污染。目前在我国兽用疫苗的生产中技术人员检测支原体的存在和鉴定支原体的种类，以便有针对性地切断支原体污染。