禽流感病毒H7N9亚型三重荧光PCR检测方法研究

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(郑州中道生物技术有限公司，河南 郑州 450000)

0 引言

流感病毒属于正粘病毒科，基因组是单股、负链、多节段的核糖核酸(RNA)分子。根据流感病毒核蛋白(NP)抗原性差异，可将流感病毒分为A、B、C三型，其中A型流感病毒为最常见的流感病毒，宿主范围广泛，可感染大多数哺乳动物、家禽以及野鸟。根据流感病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)氨基酸的差异，又可将A型流感病毒分为多个HA亚型和NA亚型。禽流感病毒属于A型流感病毒，根据致病能力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和非致病性禽流感。高致病性禽流感传染性极强，以高发病率和高致死率为特征，对禽类养殖业危害巨大，因此世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的动物疾病，中国政府也将其列为一类动物疫病，引起HPAI的毒株主要集中在H5和H7亚型[1-2]。

2013年，我国上海、江苏和浙江等地先后发生H7N9禽流感病毒感染人事件，并引起死亡[3]。分子流行病学资料表明，2017年从病人体内分离的H7N9病毒出现血凝素裂解位点突变，该突变提示病毒致病性可能发生变化，进一步危害公共卫生安全[4]。

本研究以禽流感病毒H7N9亚型HA裂解位点和NA基因为检测靶标，以实时荧光定量PCR为模型，建立一种敏感、特异、多重高效的流感病毒核酸检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

引物和探针委托华大基因合成；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶采购自takara公司；PCR常规试剂均采购自赛默飞公司；H7N9病毒和其他常见禽病病毒核酸由中国科学院微生物研究所馈赠。

1.2 方法

1.2.1 引物探针制备

参考GenBank毒株序列KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，使用NCBI提供的在线工具Primer-BLAST进行引物探针设计。

1.2.2 阳性对照制备

参考GenBank毒株序列KY643843.1、KF922738.1、KY643847.1，设计引物扩增H7N9经典毒株HA基因，变异毒株HA基因和NA基因，并将3个基因片段连接到pUC57质粒。用常规方法提取质粒，并用无Rnase纯化水稀释至2×106copies/μL，置-20℃以下保存。

1.2.3 阴性对照制备

量取1 mL焦炭酸二乙酯迅速加入装有1 000 mL去离子水的瓶中，封口，震荡混匀，2℃～8℃放置8～16 h。121℃高压灭菌25 min，置-20℃以下保存。

1.2.4 RT-PCR反应条件及阈值判定

根据不同探针设置对应的荧光通道，确定RT-PCR反应程序及方法阈值。

1.2.5 敏感性试验

将H7N9经典毒株和变异毒株核酸混合，按10倍梯度进行稀释，用本方法检测。

1.2.6 特异性试验

使用该方法检测H5、H9等其他亚型禽流感病毒，以及其他禽类常见病毒核酸，包括H7N9变异毒株、H7N9经典毒株、新城疫病毒、传染性法式囊病病毒、禽白血病病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。

2 试验结果

2.1 引物探针制备

用于检测H7N9病毒HA基因的引物对及其探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’；H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’；H7-P：5’-ROX-ACATAGATAGCAGGGC-BHQ2-MGB-3’；ROX为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团。

用于检测H7N9变异毒株HA基因的引物对及其探针序列如下：H7-F：5’-ACCGTGCAAGCTTCCTGAGA-3’；H7-R：5’-TGAAACCCGCTATAGCACCA-3’；H7变异-P：5’-FAM-AGAGAAAACGGACTGC-BHQ1-MGB-3’；FAM为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团。

用于检测H7N9病毒NA基因的引物对及其探针序列如下：N9-F：5’-ATGCCCAGTAGTGTTCACCG-3’；N9-R：5’-TGTCCTCCCTAGCCAAGTGT-3’；N9-P：5’-VIC-GTCTCTGACTGGAACT-BHQ1-MGB-3’；VIC为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团。

上述引物和探针由华大基因公司合成。

2.2 RT-PCR反应程序

在荧光定量PCR仪上运行以下程序：42℃30 min，95℃3 min；然后进行94℃10 s，60℃30 s；40个循环。荧光通道选择FAM、VIC、ROX，其中FAM用于检测突变毒株HA基因，ROX用于检测野生株HA基因，VIC用于检测NA基因，在每个循环的60℃时收集荧光信号。设置扩增体系为20 μL，同时要选择passive reference和quencher为none的模式。

2.3 基线和阈值设定

基线调整取6～15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点；质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线或Ct值>37或无；阳性对照Ct值均≤30.0，且出现三条明显的扩增曲线，否则实验视为无效；样品判定：待检样品若FAM、ROX和VIC三条通道荧光信号均有指数型增加，且结果均显示Ct值<34.0，则报告为高致病H7N9阳性；待检样品若ROX和VIC两条通道荧光信号均有指数型增加，且结果均显示Ct值<34.0，则报告为低致病H7N9阳性；待检样品若Ct值>37.0或无明显扩增曲线时报告为阴性；34≤Ct值≤37时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

2.4 敏感性试验

将H7N9经典毒株和变异毒株阳性核酸混合，按10倍梯度进行稀释。用本方法检测稀释样本，灵敏度可以达到100～101个EID50。

2.5 特异性试验

本方法具有良好的特异性，检测结果不受其他亚型流感病毒以及常见禽类病毒的干扰，并且能够鉴别在对H7N9变异毒株和经典毒株核酸样本。

3 讨论

本研究开发了一种用于检测H7N9禽流感病毒经典毒株和变异毒株的多重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，利用多重荧光RT-PCR技术，可快速、高效地甄别人和动物中的H7N9低致病性经典毒株和高致病性变异毒株。本研究以H7N9禽流感病毒HA裂解位点突变位置的基因序列为分子标识设计MGB探针，建立H7N9病毒经典毒株和变异毒株血凝素(HA)双重检测体系，然后结合保守的神经氨酸酶(NA)基因检测体系，组成三重荧光RT-PCR检测方法。

本研究使用MGB-Taqman探针，克服了多重PCR引物、探针、目的产物相互干扰等问题。探针3’末端使用BHQ作为淬灭基团，而BHQ本身不产生荧光，荧光背景低，灵敏度高；在传统Taqman探针基础上，MGB-Taqman探针在3’末端偶联MGB (Minor Groove Binder)。MGB能够与DNA的小沟结合，使探针与靶DNA形成极为稳定的异源双链，从而可将Tm值提高约10℃，大大提高了荧光PCR方法的特异性；MGB探针较短(14～20bp)，因而更适合于短小变异序列的特异性识别，容易设计。而且3’端淬灭基团与3’端报告基因在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。