植物油DNA提取和基因检测的研究进展

2018-02-14李晓萌

现代食品 2018年5期

◎ 李晓萌

（沈阳食品检验所微生物检验室，辽宁沈阳 110000）

植物油属于酯类物质，主要由高级脂肪酸、甘油组成，常温状态为液态。植物油在人们生活中占据着不可替代的位置，而当今市场上植物油掺假、转基因植物油标识混乱的情况，极大地影响了消费者权益，同时也威胁到了人们的身体健康[1]。为此，需要采取有效措施了解植物油转基因成分及真实性，常规方法主要包括仪器分析、理化分析等，随着分子生物学的发展，也可以此为基础，采取新的基因检测方法。DNA热稳定性、酸碱耐受性良好，为分子生物学检测提供了可能。

1 植物油DNA提取

1.1 提取步骤

植物油DNA提取中，主要步骤包括裂解、纯化等。通过裂解将DNA在裂解体系中释放，通过纯化使有利DNA和裂解体系中盐、多糖、蛋白质等其他成分进一步去除分离[2]。在裂解过程中，可以采用机械裂解、酶裂解、化学裂解等方法。纯化当中，使用氯仿、酚等作为有机溶剂，经过抽提后将DNA沉淀出，使用磁珠、吸附树脂等吸附DNA，然后将DNA洗脱。在DNA提取的不同方法中，主要差异存在于裂解、纯化等过程，可以对裂解、纯化方法加以优化，进而使植物油DNA提取效率提升。不同于其他物质，植物油属于高度深加工纯化产品，含有较高的油脂类物质，严重破坏DNA，并大幅降低含量。所以，植物油DNA提取中，使用乳化法等方法在裂解前需要做好前处理，将其中油类物质去除，将更多残留DNA分离出。

1.2 提取方法

植物油DNA提取中，常用方法包括十二烷基磺酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等。SDS是一种阴离子去污剂，可在高温下，促使细胞裂解和蛋白质变性，结合蛋白质、糖类等形成多重物，分离DNA和其他成分。可提升盐浓度，降低温度，以降低SDS多重物溶解度，沉淀多糖、蛋白质，进而纯化DNA。SDS方法是当前提取DNA常用的方法之一，操作简单，成本较低，提取DNA完整性较好。CTAB是一种阳离子去污剂，也可和DNA形成多重物。在高盐浓度下，多重物溶解，低盐浓度下，溶解度降低，产生沉淀，多糖、蛋白质仍在溶液中溶解，采取离心操作，分离多糖、蛋白质与DNA多重物，进而纯化DNA，将CTAB去除得到DNA[3]。CTAB在裂解液中作为主要成分，能够对细胞裂解，并将杂质成分去除。对裂解液成分优化，能够提高植物油DNA提取效率。

2 植物油基因检测

2.1 普通PCR法

PCR即聚合酶链式反应，是一种先进的分子生物学技术，能够在体外扩增微量特定DNA片段。常规PCR检测中，包括PCR扩增、电泳分析等流程，在食物有转基因成分检测，掺假检测中已经得到广泛应用。例如，相关研究中采用PCR法对市面上10种精炼大豆油DNA进行检测，得出结果和样品标识相同。对2种大豆油DNA进行PCR扩增，结果表明转基因而大豆内源基因中，都产生了扩增条带，符合产品标识，证明PCR可以对植物油外源基因加以检测[4]。普通PCR方法成本低、效率高，对仪器没有太高要求，但在目标基因扩增后，需要采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，由于检测样品中，DNA含量通常较低，条带亮度不足，对最终结果产生影响。同时，电泳操作中使用有毒试剂，可能危害人体健康，因而该方法实际应用有所限制。

2.2 多重巢式PCR法

巢式PCR方法，是聚合酶链式反应的变异形式，对完整片段扩增，运用了2对PCR引物。其中，第一对引物扩增片段，类似于普通PCR，第二对引物，叫做巢式引物，在第一次PCR产物内部结合，进而相比第一次扩增，缩短第二次PCR扩增片段。在第一次扩增形成错误片段后，第二次就几乎不会在错误片段扩增。这种方法在应用中，极大地提高了扩增的灵敏度、特异性。在多重PCR方法中，能够同时对不同位点基因扩增，进而提升基因检测效率。

2.3 实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR方法，是对普通PCR方法加以改进，将荧光基团加入反应体系，通过积累荧光信号，实时监控PCR反应进程。对比标准曲线，定量检测位置模板。在相关研究中，对市面上出售的品牌大豆油DNA实时荧光定量PCR检测，检测结果均呈阳性，符合产品标识。还有研究中，也选择了10种植物油，采用实时荧光定量PCR方法检测，结果表明6种植物油扩增结果为阳性，符合产品标识[5]。另外，采用实时荧光定量PCR方法，检测花生油、棕榈油、大豆油混合植物油，结果证实能够对植物内源基因进行检测。在植物油基因检测中，实时荧光定量PCR方法，特异性强、灵敏度高、再现性好，相比于普通PCR方法，减少了琼脂糖凝胶电泳鉴定的过程，避免了交叉污染，但对仪器条件提出更高要求。

2.4 环介导等温扩增法

环介导等温扩增法是一种DNA扩增处理的新型方法，可以6个靶基因区域为基础，分别对4种特异引物加以设计。基于链置换DNA聚合酶作用，60～65 ℃恒温条件下，对DNA片段恒温扩增。在实际检测中，有恒温扩增操作、产物检测操作等流程。环介导等温扩增法是DNA恒温扩增的重要方法，扩增过程一般在恒温水浴锅当中进行。在恒温条件下，环介导等温扩增法和普通PCR方法相比，能够提升2～5个数量级。同时，该方法对仪器条件要求不高，具有较强的特异性，操作比较简便，检测成本可控，判断结果难度较低。但在该方法的实际应用中，引物设计难度通常较大，复杂度较高。在扩增产物处理中，可能导致DNA污染的情况。另外，检测中也有一定机率出现假阴性的结果，需要加以注意。