血凝和血凝抑制试验常见问题浅解

赵 晖

（辽宁省大连市普兰店区动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116200）

兽医实验室中，常利用血凝和血凝抑制试验，对禽流感、新城疫等具有血凝性的病毒进行鉴定或对发病禽群进行疫病诊断、对禽群的免疫状态进行评价等。

1 定义与原理

1.1 血凝

某些病毒或病毒的血凝素，能选择性的使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。

1.2 血凝抑制

当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接反应，也称血凝抑制反应。

2 血凝和血凝抑制试验的操作细节

自备器材、试剂；领取病毒抗原、标准阳性血清、标准阴性血清；制备1%鸡红细胞；血凝试验，判定；4HAU回滴；稀释抗原；血凝抑制试验；判定结果。

2.1 自备器材、试剂

96孔V型反应板，微量移液器、阿氏液、pH7.2 0.01mol/L PBS液。

2.2 领取抗原

领取禽流感或新城疫抗原及相对应的标准阳性血清、标准阴性血清。

2.3 1%鸡红血球的制备

取3只或3只以上SPF公鸡或无禽流感和新城疫等病原感染的的健康公鸡的血液与阿氏液等体积混匀，用PBS液（pH7.2、0.01mol/L）反复洗涤3次，每次以 2000转 /min（用于新城疫抗体检测)）或1000转/min（用于禽流感抗体检测）离心10min，洗涤后的红血球与PBS液混合均匀，配置成1%的红细胞悬液，置4℃冰箱冷藏。

2.4依据GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术、GB/T16550-2008新城疫诊断技术进行血凝试验、4HAU回滴、稀释抗原、血凝抑制试验的操作。

2.5 HI结果判定

以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。阴性对照孔血清滴度小于或等于2log2，阳性对照孔血清不超过1个滴度的误差，作为实验成立的先决条件。以禽流感为例，HI≤3log2判定HI试验结果为阴性；HI价＝4log2试验结果为可疑，需要重复试验，HI≥5log2试验结果为阳性。

3 血凝与血凝抑制试验注意事项

3.1 4HAU抗原最好现用现配制

3.2 抗原滴加的顺序

每次向板内滴加抗原时，移液器滴头要与平面45度悬空，不要触碰到孔内的液体，由后向前依次滴加（即浓度由低往高滴加）。

3.3 抗原抗体反应时间

抗原抗体在室温20～25℃下，必须反应30min以上，若环境温度低于室温，可将微量反应板置于恒温培养箱中，使二者充分反应。

3.4 磷酸盐缓冲液的PH值

磷酸盐缓冲液的pH值要在高压灭菌后进行滴定，往往在高压后pH值会有所改变，所以高压后再调一次pH值更为准确。磷酸盐缓冲液一经使用保存期不要超过3周。当pH＜5.8时，红细胞会产生自凝现象；当pH＞7.8时，图形洗脱加快，易造成肉眼观察产生误差；pH＝7.2时，红细胞沉降最充分，图形最清晰。

3.5 采血鸡的只数要求3只以上

将鸡血放置于15mL离心管内进行洗涤，避免使用1.5～2mL离心管洗涤。

3.6滴加1%红细胞悬液时，要经常晃动红细胞悬液，使红细胞均匀分散在磷酸盐缓冲液中，防止红细胞下沉。

3.7 判定时间

加入鸡红血球之后，反应板在室温（20～25℃）静置30～40min，对照孔血球下沉于孔底，即可判定结果。若室温达不到实验要求，需相应调整反应时间。当环境温度低于4℃时，红细胞发生自凝；高于37℃时，会发生反应物分离和红细胞溶血。

3.8检测禽流感抗体时，洗涤鸡红细胞离心转数为：1000 RPM，离心10min；检测新城疫抗体时，洗涤鸡红细胞离心转数为：2000 RPM，离心10min；1000 RPM和2000 RPM离心转数离心鸡红细胞压积不一样，导致1%鸡红细胞浓度不一样，影响检测结果。