环介导恒温扩增技术在百日咳鲍特菌检测中应用研究进展

2018-02-14郄春花综述吴红章审校

检验医学与临床 2018年21期

郄春花综述，吴红章审校

(天津市第二人民医院检验科，天津 300192)

核酸扩增技术是病原微生物检测的重要武器，其中聚合酶链反应(PCR)技术已经在临床检验中广泛应用。与PCR相比，环介导恒温扩增(LAMP)技术具有操作简便，快速灵敏，对仪器和样本质量要求低等优点，尤其适合病原微生物的即时检验。本文主要综述了LAMP技术在百日咳即时检验中应用的研究进展。

1 百日咳的流行病学

百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的一种严重急性呼吸道传染病，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见，给婴幼儿身体健康造成严重威胁。其临床症状特征为阵发性痉挛性咳嗽，病程可迁延数月，常引起流行。家庭内成人患者和潜在感染者是儿童百日咳的主要传染源。人是百日咳鲍特菌的唯一宿主，由于疫苗产生的抗体滴度随着年龄的增长而降低，孕妇体内的抗体传送给胎儿很少，因此婴儿对百日咳鲍特菌的抵抗力弱，加上未达到疫苗接种年龄，导致小于6个月龄的婴儿百日咳的发病率明显较其他年龄组高。近年来，儿童百日咳发病率逐年升高，并出现一些新的流行特征，已经成为儿科临床医师广泛关注的传染性疾病。百白破联合疫苗的使用有效降低了百日咳的发病率及病死率。尽管疫苗接种率很高，近年来在许多发达国家和发展中国家百日咳的发病率呈持续上升趋势，在一些国家和地区甚至出现暴发流行，百日咳再现的现象引起了广泛关注[1]。百日咳再现的主要原因是疫苗接种对年长儿、青少年及成人覆盖率不足，成人百日咳感染率增加，以致未接种疫苗或未完成全程疫苗接种的婴幼儿发生百日咳感染[2]。自上世纪90年代以来，百日咳再现于疫苗覆盖人群，产生这种现象的一部分原因是诊断技术的发展，医生警惕性提高，人群免疫减弱和病原的选择性。百日咳再现指出了建立快速、敏感、特异的实验室诊断方法的重要性[3]。

2 百日咳的实验室诊断现状

目前对于百日咳的诊断主要是依靠临床医生对症状的判断，但临床医生对非典型病例的认识存在严重不足。包括我国在内，目前大多数国家和地区用于百日咳诊断的临床标准中多数要求咳嗽时间至少在两周以上，但是由于非典型病例的增多，部分病例会因此延误诊断。因此，对于这些不典型的百日咳感染，尤其是青少年和成年人的隐性感染，需要结合可靠的实验室诊断方法来帮助确诊[4]。

百日咳的主要实验室诊断方法包括细菌培养法、免疫学方法和基因检测方法。尤其对于症状不典型的百日咳感染患者，实验室诊断方法是确诊百日咳感染的重要手段。传统的细菌培养法虽然是诊断百日咳的金标准，但是存在培养时间长、阳性率低等缺点。本法检测百日咳鲍特菌特异度高，但是灵敏度受到标本运送条件、标本质量、病程和抗菌药物等多种因素限制。免疫学检测是对病原微生物抗原抗体的检测，容易出现假阳性。其中以PCR为基础的百日咳基因检测方法的灵敏度好，阳性率高，并且受抗菌药物使用的影响小。但是百日咳普通PCR检测方法还存在使用强烈致癌剂溴化乙锭作为染色剂、扩增时间长、依赖昂贵仪器、基层实验室无法开展等一些不足。鉴于上述原因，研究新的快速、敏感、特异、便于操作的百日咳诊断技术就显得十分必要。

3 LAMP技术概述

LAMP是一种新的核酸体外恒温扩增技术[5]。LAMP技术主要通过一组特异性引物针对目的基因的6个特定区域，在恒温扩增环境条件下(60～65 ℃)，依赖于一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，高效率(30～60 min)地扩增目标 DNA。LAMP产物的检测可根据反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀，或在反应系统中加入荧光染料，可以用肉眼或实时检测仪器判断扩增与否[6]。

与PCR技术相比，LAMP技术对标本前处理要求不高。有些病原体可以用简单处理的标本作为模板，例如甲型流感病毒LAMP检测试剂盒对标本处理要求是，只需把拭子标本在核酸提取试剂中进行简单搅拌即可完成标本中DNA的抽取。甚至有研究显示，省略标本DNA提取步骤，不会影响LAMP扩增的灵敏度[7-8]。LAMP方法不仅对核酸提取要求低，而且灵敏度高，可从极微量的标本中扩增出目的基因，其最低检测限是传统PCR的10～100倍[9-10]。

虽然LAMP技术是一种快速、简便的核酸扩增方法，但该技术在结果呈现方面仍然表现出不足和缺陷。该方法在检测过程的某些环节存在很多提升空间，LAMP扩增产物的可视化成为近年的研究热点。LAMP-横向流动试纸条(LFD)技术是LAMP与LFD相结合的一种新技术，该技术将核酸恒温扩增和可视化试纸条检测有机地结合，使 LAMP 扩增产物现场检测可视化[11]。检测过程中加入特异性探针，不仅提高了检测的特异度，而且摆脱了对检测仪器设备的依赖，而无需EB等有毒试剂。LFD技术结合了严格的碱基互补配对原则、抗原抗体反应的高特异度和PCR的高灵敏度，并融合了免疫层析技术和分子生物学手段[12]。

LAMP-LFD技术在保留了LAMP优点的基础上，在产物可视化检测方面又迈进了一步，使检测过程更加便捷，摒弃了昂贵仪器的依赖，大幅度降低了从核酸扩增到结果展示过程中的仪器成本。LAMP-LFD技术在检测的灵敏度和特异度方面具有特殊优点，其作为一种终极模式在微生物的即时检验方面具有无与伦比的优势。目前也有将LAMP-LFD技术用于麻疹病毒检测的报道[13]。

4 LAMP在百日咳检测中的应用研究

自LAMP技术问世以来，以其检测的快速、敏感、低设备依赖性等优点在微生物检测方面得到了广泛应用。随着分子生物学的发展，LAMP技术不断应用于百日咳鲍特菌基因快速检测，这些报道大多针对百日咳基因的插入序列IS481、百日咳毒素(PT)和目的基因BP485基因等片段。

BROTONS等[14]建立了检测百日咳鲍特菌基因的LAMP方法。该实验中LAMP扩增可在12～30 min内完成，检测限可达2 CFU/mL，是实时PCR的2.5倍。用这个方法检测百日咳的灵敏度为96.55%，特异度为99.46%，线性范围为10～105CFU/mL，适合用于百日咳鲍特菌的即时检验。KAMACHI等[15]建立了一种检测百日咳鲍特菌的LAMP方法，其检测结果与传统PCR一致，且该LAMP法特异度高，与其他种属鲍特菌无反应。NAKAMURA等[16]用LAMP方法检测一名出生28 d女婴鼻咽拭子和气管吸出液中的百日咳鲍特菌基因，这两种标本均发现扩增信号。由于婴幼儿百日咳的临床症状不典型，LAMP方法对于婴幼儿百日咳的诊断具有不可替代的优势。