创伤脓毒症患儿外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例变化及其意义

高 强，李政委，李大进，朱炳鑫，秦海辉

(徐州医科大学附属徐州儿童医院创伤外科 221006)

脓毒症为创伤外科常见的全身炎性反应综合征，发病率较高，可诱发器官衰竭综合征，严重时可能导致死亡[1]。脓毒症并非仅仅是过度炎性反应，它是炎性反应和抗炎反应相互作用过程中机体免疫功能紊乱的结果。脓毒症病程进展过程中，涉及机体多种免疫细胞之间平衡的失调和免疫调节网络的紊乱。儿童由于自身免疫功能尚不完善，在发生严重创伤时，更易由感染诱发脓毒症，造成严重后果。调节性T细胞(Tregs)是T淋巴细胞的一个亚群，具有强大的免疫抑制功能，是维持人体免疫系统稳态不可或缺的一部分。曾一度被认为仅存在于胸腺来源的CD4+Foxp3+T细胞之中的转录因子Helios在Tregs中呈高水平表达[2-3]。Helios是维持CD4+Foxp3+T细胞稳定抑制能力所不可或缺的角色[4]，同时是具有抑制功能的调节性T细胞的标记物[5-6]。既往研究表明，Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例在多种免疫相关的疾病中扮演了重要角色，但其在儿童创伤后脓毒症中的作用鲜有报道[7-11]。本研究旨在通过检测创伤脓毒症患儿外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例的变化，分析Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例与相关细胞因子表达水平间的潜在关系，探讨Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例在儿童创伤脓毒症中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2015年1月至2017年6月收治的60例创伤脓毒症患儿纳入脓毒症组，经病原学及影像学检查确诊，符合2005年国际儿科脓毒症年会所制定的小儿脓毒症诊断标准[1]，其中男36例，女24例；平均(8.56±2.33)岁。选择同期入院但未发生脓毒症的60例创伤儿童纳入创伤组，其中男32例，女28例；平均(9.21±3.12)岁。同期本院60例健康体检者纳入对照组，其中男30例，女30例；平均(8.94±2.79)岁。所有研究对象排除标准：患有自身免疫疾病、严重的慢性疾病、或是长期服用糖皮质激素的儿童。本研究经本院伦理委员会审核通过后进行，所有研究对象监护人均对本研究知情同意。

1.2方法 所有研究对象均空腹8 h后抽取静脉血2 mL于肝素抗凝管内，室温静置30 min后以300×g速度离心7 min，分离上层血浆，分装保存于-80 ℃冰箱内待测。用淋巴细胞分离液对血细胞进行密度梯度离心，分离得到单核淋巴细胞；对单核淋巴细胞进行特异性抗体染色后进行流式细胞学检测，并采用Flowjo V10软件进行流式数据分析。应用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血浆中细胞因子白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β1的水平。应用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术，检测外周血单核淋巴细胞中转录因子Helios及Foxp3的mRNA表达水平。

2 结 果

2.13组研究对象Tregs比例检测结果比较 脓毒症组、创伤组及对照组外周血中转录因子Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例分别为(85.37±11.25)%、(66.56±10.86)%、(63.72±9.88)%，脓毒症组明显高于创伤组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。脓毒症组、创伤组及对照组外周血CD4+Foxp3+Tregs细胞比例分别为(7.90±1.31)%、(6.88±1.02)%、(2.79±0.31)%，脓毒症组和创伤组明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，脓毒症组与创伤组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.23组研究对象血浆IL-10、TGF-β1水平比较 ELISA法检测结果显示，脓毒症组、创伤组及对照组血浆中IL-10水平分别为(25.46±3.67)、(20.51±2.91)、(17.47±0.89)pg/mL，脓毒症组明显高于创伤组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。脓毒症组、创伤组及对照组血浆中TGF-β1水平分别为(45.26±8.62)、(41.81±7.11)、(33.79±6.97)pg/mL，脓毒症组明显高于创伤组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例与血浆IL-10、TGF-β1水平相关性分析 IL-10(r=0.627，P=0.001)、TGF-β1(r=0.638,P=0.001)与外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例间呈显著正相关。

2.43组研究对象外周血单核淋巴细胞转录因子Helios及Foxp3的mRNA表达水平比较 脓毒症组、创伤组及对照组外周血单核淋巴细胞Helios的mRNA表达水平分别为4.88±1.77、3.21±1.29、0.96±0.18，脓毒症组明显高于创伤组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。脓毒症组、创伤组及对照组Foxp3的mRNA水平分别为3.76±1.30、3.68±1.21、0.87±0.15，脓毒症组及创伤组明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但脓毒症组与创伤组之间，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

2001年美国医师协会等多个相关组织在华盛顿召开会议，将脓毒症定义为由微生物引起的全身炎性反应综合征[1]。美国每年约75万人发生脓毒症，病死率为20%～60%；我国每年也有大量脓毒症患者，死亡人数近百万。儿童患者免疫功能尚未发育健全，病情进展迅速，更应引起重视。脓毒症发生时机体炎症细胞激活，引其自身系统性炎性反应。Tregs是T细胞的组成部分，在抑制炎性反应过程中发挥重要作用，Tregs数量异常或是功能降低均可能导致机体免疫功能失调，导致疾病发生。Tregs通过产生IL-10抑制Teffs激活及后续一系列的免疫炎性反应[12-13]，并通过分泌TGF-β1抑制其他T细胞的作用，阻碍辅助T细胞及细胞毒性T细胞的激活[14-16]。Foxp3曾被认为是Tregs标记物[11,17-18]，然而进一步研究发现，Foxp3既表达于具有抑制功能的Tregs，也可以出现在效应性T细胞中[19-20]。

Helios是属于Ikaros家族的核内转录因子，近期研究认为Helios是具有抑制功能的Tregs的标记物[5-6]，本研究发现，创伤脓毒症患儿外周血中Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例相对于创伤组和对照组明显升高，且血浆细胞因子IL-10、TGF-β1与Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例存在显著正性相关关系。细胞因子IL-10是人类细胞因子的合成抑制因子，是具有免疫调节和抗炎作用的细胞因子，被视作Tregs标记物之一，研究证实，Tregs通过产生IL-10从而抑制Teffs激活及免疫炎性反应。TGF-β1是转化生长因子超家族成员，它承载多项细胞功能，包括调控细胞生长繁殖，细胞分化凋亡等。Tregs能够分泌TGF-β1，进一步抑制其他T细胞效应功能，从而抑制免疫炎症反应。本研究发现，Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达水平同以上两种细胞因子的表达水平之间存在正相关关系，由此笔者猜测，过度表达的Helios在CD4+Foxp3+Tregs中的表达比例可能在创伤脓毒症患儿疾病进展中产生了潜在的影响，抑制了机体的正常免疫炎性反应，导致疾病病程进展，但其具体作用机制仍待进一步研究。