不结球白菜金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

刘东让，侯喜林，张昌伟，肖 栋,*

(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081；2 南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；3 江苏现代园艺工程技术中心，南京 210095)

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一种富含半胱氨酸短肽的低分子量蛋白，普遍大小为5～10×103Da[1]。1957年，金属硫蛋白在马肾皮质中被发现，植物MT最早是于1977年从大豆根中发现，现已发现MT广泛分布于动物、植物、真菌及细菌等几乎所有生物体内[2-6]。Fowler等[7]根据MT中Cys残基的排列方式，将所有生物的MT分为3类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类)。

植物中，根据半胱氨酸残基数目和排列的不同可将MT归为Ⅱ类[8-9]。根据Cobbett等[10]的分类，可将植物Ⅱ类MT进一步分为4种类型：MT1(p1)、MT2(p2)、MT3(p3)与MT4(pec/Ec蛋白)。已有研究表明，植物MT2包含2个富含半胱氨酸的结构域，每个域包含1个高度保守的MSCCGGNCGCG结构以及3个Cys-Xaa-Cys模块，被大约40个的氨基酸残基连接，多分布在地上部分[11]。据报道，MT与植物的生长发育、胚发育、果实成熟、衰老、抗逆反应以及基因调控等过程有关[12]。目前多数研究认为，MT的主要功能是与生物体内的金属离子相结合，从而起到运输、储存金属离子、维持细胞内的氧化-还原平衡等作用，而且生物体内的MT大多需经过金属离子、细胞分裂素、盐、干旱等胁迫诱导才会表达[13]。植物激素脱落酸(ABA)作为重要的内源信号物质，在诱导植物抗病反应中发挥了重要作用[14]。因此，克隆MT基因并分析该基因的表达特征，对探讨不结球白菜对逆境的响应机理及抗逆分子育种具有重要价值。人们已从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)、芹菜(ApiumgraveolensL.)、平邑甜茶(Malushupehensis)等植物中克隆了编码MT蛋白的基因或cDNA 序列[1,12,15-17]。但与对动物MT的研究相比，对植物MT的研究远远不足[18]。近年来，对植物MT基因在组织器官特异性、表达特征和基因组结构等方面的研究得到一定发展[4]。尽管已从植物中克隆到许多编码MT的基因，但对不结球白菜MT基因的研究报道很少。

不结球白菜(Brassicacampestris ssp.chinensis)是中国重要的绿叶蔬菜，由于世界范围内的广泛引种，不结球白菜逐渐成为世界性蔬菜[19]。各类病害、外源ABA、盐、干旱等生物和非生物胁迫常影响不结球白菜生长发育，导致其产量下降，品质降低[14,20]。因此，本研究以cDNA-AFLP方法从不结球白菜中获得的受霜霉病菌诱导的差异表达片段为基础[21]，利用RACE技术从不结球白菜抗病系‘苏州青’中克隆了BcMT2基因，并进行了氨基酸序列分析。同时通过qRT-PCR技术分析BcMT2基因在不同组织、生物胁迫(霜霉病菌)及非生物胁迫(盐、干旱、ABA)处理条件下的表达模式，并通过原核表达对该基因的蛋白特征进行鉴定。旨在深入研究MT基因在不结球白菜上的表达模式，进而为选育高产、优质的新品种提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试材料为南京农业大学园艺学院白菜课题组提供的不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’。所有的种子先在1.0 g·L-1HgCl2里消毒20 min，再用蒸馏水冲洗10次。后将2个品种的种子分别播种于2个72孔穴盘的灭菌基质中，后放置于人工气候箱中培养，每日22 ℃光照培养16 h，16 ℃暗培养8 h，相对湿度(85%±5%)。待催芽28 d(5～6片真叶)后，分别从2个品种中选出63株长势良好的植株用于诱导处理。

1.2 实验方法

1.2.1生物、非生物胁迫处理及取样从感病的不结球白菜上分离霜霉病菌(P.parasitica)，配成1×105mL-1孢子囊悬浮液，霜霉病病原菌接种液的制备参照陈晓峰[22]的方法。播种28 d后，分别用霜霉病接菌液、200 g·L-1PEG6000、400 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA及纯水对选出的植株进行处理，取样时间点有5个，每个时间点3个重复，即每个品种每个胁迫处理15株植株，纯水处理需3个重复，总计每个品种需63株样本。处理后在人工气候箱20 ℃黑暗中保湿24 h，然后揭掉遮光物，再在22 ℃光照培养16 h，16 ℃暗培养8 h，相对湿度(85%±5%)条件下培养，直至采样结束。组织特异性表达分析使用的材料分别取自2份未经胁迫处理的不结球白菜植株苗期(播种后28 d)的根、茎、叶。胁迫处理表达分析，分别在处理后12、24、48、72和96 h进行取样。上述材料取样后立即在液氮中冰冻，使用前保存在-70 ℃冰箱中。

1.2.2RNA提取和cDNA合成使用RNA Simple Total RNA Kit试剂盒(TaKaRa)提取样品总RNA，具体方法参照说明书。用核酸仪对提取的总RNA浓度和纯度进行检测。cDNA使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)反转录合成，作为基因克隆所需的模板。

1.2.3BcMT2全长cDNA克隆以霜霉病菌诱导后24 h的不结球白菜‘苏州青’叶片为试材，使用3′/5′RACE System 试剂盒(Invitrogen)克隆基因全长cDNA序列。具体操作过程参考陈晓峰[22]的方法。克隆BcMT2基因的引物见表1，引物设计用在线软件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，引物由南京擎科公司合成。

1.2.4序列分析用Bioxm 2.7软件分析BcMT2基因序列的开放阅读框(open reading frame, ORF)。

表1 本研究用到的各种引物信息

注：F.正向引物；R.反向引物；UP.上游引物；Down.下游引物；下划线为SacⅠ和BamH Ⅰ酶切位点序列；酶切位点之前碱基为保护碱基。

Note: F. Forward; R. Reverse; UP. Upstream primer; Down. Downstream primer; Underlined. Sequence ofSacⅠ andBamHⅠ. The front of the restriction site is protective bases

不同物种BcMT2基因的氨基酸序列从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中搜索获得；同源性计算利用 NCBI网站Blast程序；氨基酸编码的蛋白质相对分子质量、理论等电点、不稳定指数等通过在线软件Protparam(https://web. expasy.org/Protparam/)完成；疏水性预测采用protscale(https: //web. expasy.org/protscale/)；信号肽预测采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜区域预测采用TMHMM 2.0(http:// www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；蛋白质结构域分析采用NCBI-Conserved Domain SearchInterpro；蛋白质二级结构预测采用Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/ NPSA/npsa_phd/)等在线工具；多重序列比对及进化树构建通过DNAMAN 5.2进行[23]。

1.2.5实时定量分析BcMT2转录表达水平cDNA合成使用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa)说明书完成。实时定量PCR使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ试剂盒(TaKaRa, Japan)完成，PCR反应体系采用20 μL体系：MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，rTaq酶0.2 μL，引物BcSGT1_RT_F和BcSGT1_RT_R各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O补齐至20 μL。PCR程序采用两步法：95 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环；设置60 ℃到95 ℃的熔解曲线。3次重复，用纯水作为对照。试验数据采用ΔΔCT方法[24]和Excel 2010软件进行分析，差异显著性分析采用SPSS19.0软件进行。

1.2.6原核表达将克隆的BcMT2基因连接至pMD19-T载体，再转化DH5α感受态细胞，获得重组质粒pMD19-T-BcMT2。用SacⅠ和BamH Ⅰ双酶切及菌液PCR鉴定后，含阳性重组质粒的菌液送交南京擎科公司测序。把上述测序正确的重组质粒作为模板，以上游引物BcMT2_Up和下游引物BcMT2_Down扩增BcMT2基因编码区(表1)。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，割胶回收后用限制性内切酶SacⅠ和BamH Ⅰ双酶切，构建重组表达质粒pET29a-BcMT2，转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取阳性菌落接种至5 mL LB液体培养基中(含200 μg·mL-1氨苄青霉素)，37 ℃振荡培养过夜，以此作为种子液。取种子液用终浓度为0.6和1.0 mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导EscherichiacoliBL21 (DE3) 表达融合蛋白，设置取样时间分别为2、4、6 h。取菌液3 mL，12 000 r·min-1离心30 s，弃上清液，用100 μL的1×SDS-PAGE加样缓冲液重悬菌体，将上清液参照Tashakkori等[25]的方法进行SDS-PAGE分析。

2 结果与分析

2.1 BcMT5基因cDNA全长克隆以及序列分析

以cDNA-AFLP方法从不结球白菜中获得的霜霉病菌诱导的差异表达片段(397 bp)为基础，采用RACE技术获得其全长，命名为BcMT2(登录号为AB439836)。该基因cDNA序列全长为528 bp，含有243 bp的完整开放阅读框，编码80个氨基酸(图1)。预测其编码蛋白质化学式为C319H497N91O117S17，分子质量为8.02×103Da，理论等电点为4.61。属于酸性蛋白，不稳定指数为43.29，属于不稳定蛋白，脂肪指数为22.00。ProtScale亲/疏水性预测显示：该蛋白属于亲水性蛋白，总平均亲水指数(GRAVY)为-0.245；该蛋白无信号肽，并且不存在跨膜区域；该蛋白在第23～239个氨基酸处有一个Metallothio-2结构域。属于植物MT2家族，又与拟南芥中的多种金属硫蛋白序列进行比对，BcMT2也属于植物MT2(图2)。蛋白二级结构预测结果显示:其为延伸链和无规则卷曲，分别占17.5%和82.5%。该基因在起始密码子ATG之前有A，符合Kozak规律；在3′端有poly(A)尾，这些都符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。

方框表示起始密码子，下划线表示Metallothio-2 结构域，*表示终止密码子图1 BcMT2核苷酸序列(上)及其 翻译的氨基酸序列(下) Square frame indicates the translation initiation codon, underline indicates the amino acid sequence of the Metallothio-2, an asterisk (*) indicates the stop codonFig.1 The nucleotide (upper row) and amino acid sequence (lower row) of BcMT2

2.2 BcMT2蛋白氨基酸序列同源性和系统进化分析

将BcMT2编码的氨基酸序列及从NCBI中BLAST获取的其他植物MT2氨基酸序列(编码区)进行系统树分析。结果(图3)显示，不结球白菜BcMT2与大白菜第5号染色体的基因(Bra029765)的相似性为100%；与萝卜、拟南芥和甘蓝相似性分别为97%、96%和95%；与高山南芥和甘蓝型油菜相似性在85%以上。表明同科植物的氨基酸序列相似度较高。由此发现十字花科植物的BcMT2蛋白与同属植物的进化关系最近，呈现种属特性。

2.3 BcMT2基因的组织特异性表达分析

结果(图4)表明，BcMT2基因在两份材料的叶中表达最强，且表达量远高于根和茎。另外，BcMT2基因在两份材料茎中的表达量存在显著差异(P< 0.05)，且在‘苏州青’茎中的表达量约为在‘矮脚黄’中的5.93倍，而在根和叶中表达量差异不显著。

图2 BcMT2和拟南芥中金属硫蛋白 氨基酸序列的进化树Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of BcMT2 and metallothioneins of Arabidopsis thaliana

图3 不同植物BcMT2蛋白的系统树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of BcMT2 proteins from different plants

2.4 生物及非生物胁迫下BcMT2的表达分析

由图5可见，霜霉病菌侵染处理下，BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于48 h达到峰值(为对照的6.01倍)，而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于72 h达到峰值(为对照的5.6倍)；在盐处理下，BcMT2基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量于12 h达到峰值(为对照的2.51倍)，而在感病品种‘矮脚黄’中的表达量于24 h达到峰值(为对照的2.22倍)；在ABA处理下，‘苏州青’中其表达量于24 h达到峰值(为对照的17.25倍)，且在‘矮脚黄’中BcMT2基因的表达趋势与‘苏州青’类似；而在2个材料中，干旱处理均抑制了BcMT2基因的表达。t测验表明在4个处理过程中，在部分时间点上抗病系‘苏州青’与感病系‘矮脚黄’之间表达量存在显著差异。表明BcMT2基因在不结球白菜受生物和非生物胁迫的干扰后参与了防卫反应，而且在抗病系植株上比感病系植株上表达更早、表达量更强。

2.5 BcMT2基因的原核表达分析

对BcMT2进行原核表达分析，发现在37 ℃条件下，0.6 mmol·L-1IPTG诱导2、4、6 h后，均没有融合蛋白表达。而1.0 mmol·L-1IPTG诱导2、4、6 h后，在底部出现明显的表达特异条带(图6)。BcMT2在E.coliBL21(DE3)中获得了表达，表达蛋白的相对分子质量约为8×103Da。

不同小写字母表示0.05水平差异显著性图4 不同不结球白菜BcMT2基因的组织 特异性表达分析 Different normal letters mean significant differeace at 0.05 levelFig.4 Tissue specificity expression profiles of BcMT2 gene in different non-heading cabbages

不同小写字母表示0.05水平差异显著性；不同大写字母表示0.01水平差异显著性图5 ‘苏州青’和‘矮脚黄’胁迫诱导后BcMT2基因的表达 Different normal letters mean significant difference at 0.05 level; different capital letters mean significant difference at 0.01 levelFig.5 Expression of BcMT2 in ‘Suzhouqing’and ‘Aijiaohuang’under stress

M. Marker图6 BcMT2基因原核表达SDS-PAGE电泳Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of the prokaryotic expression of BcMT2 gene

3 讨 论

据报道，植物MT基因家族成员的多肽长度为45～87个氨基酸残基，Cys残基含量在10～17个，而His残基含量很低[4]。本研究在通过cDNA-AFLP技术得到的一个差异表达片段基础上，利用RACE技术克隆了BcMT2基因的全长序列。通过核苷酸和氨基酸序列分析，发现BcMT2基因编码80个氨基酸，其中含有14个Cys残基，占总氨基酸数的17.5%。这与王顺才等[16]在平邑甜茶中的研究结果一致。植物MT2多肽N端通常具有高度的保守序列MSCCGGNCGCGS，Cys残基有典型的CC、CXC和CXXC排列方式，而且C端包含3个按CXC方式排列的Cys基序[10]。本研究发现BcMT2基因编码蛋白含有与之相同的保守序列MSCCGGNCGCGS，同时N端包含1个CC、1个CXXC及2个CXC基序，在C端也有3个CXC基序。这与水稻、平邑甜茶、芹菜等植物的研究结果相一致[1,16,26]。进一步，将BcMT2基因氨基酸序列与拟南芥MT氨基酸序列进行比对，构建进化树，发现与拟南芥MT2的进化关系最近。此外，多重序列比对分析表明，BcMT2基因氨基酸序列与同科的大白菜、萝卜、拟南芥等植物具有很高的同源性，其中与大白菜第5号染色体的基因(Bra029765)一致性最高(100%)。综合这些结果，不结球白菜BcMT2基因属于Ⅱ类植物MT2基因家族。

目前普遍认为，植物MT基因的表达具有明显的组织特异性。已有研究发现，MT2在地上部的表达明显高于根[1]。拟南芥AtMT1在根中表达丰富，在叶中的表达量低；AtMT2在叶中的表达量比根中的高；AtMT3主要在果实和叶中表达；AtMT4主要在种子中表达[4,18,27]。本研究也发现，BcMT2基因在不结球白菜地上部(茎、叶)中的表达量明显高于根，且叶中的表达量明显高于其他部位，这与齐世静等[28]的研究结果一致。

适宜的环境有利于白菜的生长发育，而异常的环境则会抑制白菜的生长发育，甚至导致死亡。霜霉病、干旱、盐及外源激素等外界生物和非生物胁迫会严重影响白菜的品质和产量。为了适应这些逆境，植物进化出了一套复杂的抵御系统[9]。金属硫蛋白基因在金属解毒方面可以发挥很大的作用[1,18]。目前在MT基因表达影响因素方面，金属离子研究已有很多。除此之外，MT基因表达还受环境胁迫、激素、病菌侵染等因素的调节[4,21,29]。Xiao等[21]通过cDNA-AFLP发现MT2基因在霜霉菌诱导下于48 h后表达量达到峰值。这与本实验BcMT2在‘苏州青’中的表达趋势一致，同时发现不论在抗病系‘苏州青’还是感病系‘矮脚黄’上BcMT2均受到霜霉病菌的诱导，且在抗病系比在感病系表达量更早、更强。说明BcMT2的诱导与基因型的抗病或感病能力有一定的联系。已有多项研究在不同植物上表明，盐和外源ABA处理会诱导MT基因的表达[1,16,27,29]。这与本研究结果一致，且发现BcMT2基因在不结球白菜抗病系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’上的表达量出现了不同时间的诱导高峰。表明BcMT2涉及的防卫反应可能是在不同时间段，通过产生不同的信号途径对外源胁迫发挥作用。另有研究显示，干旱胁迫下MT基因的表达大幅度上升[30]。而陈逸云[1]则在芹菜品种‘六合黄心芹’中发现，干旱胁迫会抑制MT2基因的表达。本研究结果与陈逸云[1]类似，在干旱胁迫下，BcMT2基因在2个不结球白菜品种中的表达均受到了抑制。

BcMT2原核表达分析发现，分别在37 ℃、1.0 mmol·L-1IPTG诱导2、4、6 h后，检测到了一条蛋白分子质量约为8×103Da的表达特异条带，其与预期融合蛋白的相对分子质量的理论值8.02×103Da相符。而含有转化子但未经诱导的菌体在该蛋白条带处未出现此条带，因此可以基本确定这一蛋白条带为表达的融合蛋白。

综上所述，不结球白菜BcMT2基因属于Ⅱ类植物MT2基因家族，受霜霉病菌、盐、外源激素ABA等外界生物和非生物胁迫诱导表达，表明不结球白菜BcMT2基因在处于生物胁迫和非生物胁迫等逆境环境中均发挥着重要作用，且BcMT2在大肠杆菌中成功实现融合表达，这为下一步蛋白水平研究和转基因功能研究提供了条件，也将为选育高产、优质的不结球白菜新品种提供重要的理论依据。