兰科菌根真菌对铁皮石斛光合性能及pepc基因表达的影响

魏 明，余茂元，柴瑞娟

(安徽工程大学 生物与化学工程学院， 安徽芜湖 241000)

光合作用是植物生长发育的重要生理过程，通过研究植物叶片光合参数和叶绿素荧光参数的变化，可以了解植物光合作用与环境因子之间的关系[1]。石斛属植物具有景天酸代谢(CAM)途径的特征，其CAM途径的表达与环境变化有关[2-4]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是CAM植物光合碳代谢的源头关键酶，其基因表达量的高低对PEPC活性具有重要影响[5]。pepc基因是决定CAM植物光合碳同化速率的关键基因，通过研究pepc基因的表达，可以进一步明确环境因素对CAM植物光合碳同化的影响。

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属植物，是珍稀药用植物[6]。铁皮石斛生长缓慢，其原因与该物种的生态环境特征有关，也与根际微生物的形成有关。菌根技术是一种先进的真菌肥料技术，通过菌根技术能提高植物根系吸收水分和营养成分的能力，增强植株的抗逆性，有效提高植株的光合作用，促进植物生长[7-10]。在自然界中，绝大多数石斛在生长过程中都能与相应的真菌形成共生关系，彼此互惠互利。研究表明，石斛幼苗接种菌根真菌后，有助于提高石斛幼苗的生理活性[11]，提高其成活率，促进石斛幼苗的生长[12]，对铁皮石斛的引种驯化具有重要作用。有关菌根真菌对铁皮石斛光合性能以及pepc基因表达的影响还鲜有报道。本试验通过接种兰科菌根真菌，探讨菌根真菌对铁皮石斛光合性能以及pepc基因表达的影响，以期从光合作用角度阐明菌根真菌促进石斛生长的机制，为石斛的菌根化栽培提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

铁皮石斛无菌苗由安徽工程大学组培基地提供，菌根真菌为本实验室从野生金钗石斛中分离的丝核菌，编号为(OM12)，初步鉴定为角菌根菌属(Ceratorhiza)，由本实验室保存；栽培培养基为粉碎的树皮，营养成分为发酵过的豆饼。

1.2 接种菌剂的制备和试验设计

将菌根真菌接种在马铃薯和葡萄糖液体培养基中，28 ℃振荡培养4～6 d，得到液体菌剂备用。试验设计分为接种兰科菌根真菌(OM真菌，+M)和不接种OM真菌作为对照(-M)2种处理，每个处理重复3次。选生长一致的铁皮石斛无菌苗(苗高4 cm左右)为原始试验材料，以盆栽的方式进行培养。栽种之前，盆利用0.1% HgCl2消毒10 min，培养基在121 ℃下湿热灭菌30 min，其中培养基含有发酵过的豆饼，树皮和豆饼的比例为7∶3。幼苗移栽后开始接种菌根真菌，每隔6 d接种1次，每次接种菌剂10 mL，连续接种3次，培养温度为(25±0.5) ℃, 相对湿度为80%，光照强度为300 μmol·m-2·s-1。试验在安徽工程大学温室中进行，培养时间2017年4～9月。

1.3 生长指标和叶绿素含量测定

参考Biermann和Linderman[13]描述的方法鉴定菌根的形成情况。取1 cm左右的根段，漂洗，酸化，染色，脱色等过程，根段有颜色即表示菌根形成。随机选择处理幼苗5株，洗净后去除表面水分，测量每株的株高，分别称取根部和地上部分的质量(以鲜重表示)，3次重复取平均值。叶绿素含量采用丙酮酸/乙醇混合液法提取测定[14]。

1.4 光合作用参数和响应曲线的测定

使用Li-6400便携式光合测定系统(Licok公司 美国)测定光合作用指标。测定时的叶室配备LED红蓝光源，叶室光量子通量为300 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 μmol·m-2·s-1。选择长势一致的叶片(上午9:00～11:00取叶片)，每个处理测定3株，每株取5片叶片，每片叶取5个瞬时净光合速率(Pn)，仪器同时记录气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)等参数值。利用Li-6400的曲线测定功能，将红蓝光源设定一系列光合有效辐射强度(PAR)0、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol·m-2·s-1，在CO2浓度为400 μmol·m-2·s-1时，测定叶片Pn，绘制Pn-PAR的响应曲线，测定时叶片温度设为25 ℃。再利用Li-6400的曲线测定功能，将CO2浓度设为0、50、100、200、400、600、800 μmol·m-2·s-1，在光量子通量为300 μmol·m-2·s-1时，测定叶片Pn，绘制Pn-CO2的响应曲线。

1.5 叶绿素荧光参数的测定

采用Mini-PAM型便携式叶绿素荧光仪(WALZ公司 德国)测定叶片叶绿素荧光参数。测定时选择长势一致的叶片，每个处理测定3株，每株取5片叶片。每次测定前叶片均经过暗适应30 min，测定初始荧光(F0)、最大荧光(Fm)，计算可变荧光Fv(Fv=Fm-F0)，最大光化学效率(Fv/Fm)，潜在光化学效率(Fv/F0)。打开内源光化光(300 μmol·m-2·s-1)，至稳态后照射远红外光，测定PSⅡ实际光化学量子效率(Yield)、表观光合电子传递速率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)。

1.6 引物设计、RNA提取和cDNA合成

利用已知的铁皮石斛pepc基因序列设计定量PCR引物(NCBI检索登录号为JF423930)[15]，引物由上海生物工程公司合成，内参基因为铁皮石斛β-actin[16]，引物序列见表1。利用RNA提取试剂盒(上海生物工程公司)分别提取铁皮石斛不同生长时期的叶片总RNA。利用反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录得到cDNA用于基因的特异性表达分析，方法参照试剂盒说明书。

1.7 mRNA的RT-PCR扩增

利用SYBR Green试剂盒(Takara公司 中国)进行实时荧光定量PCR分析，在480Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche公司 瑞士)上进行试验。反应体系 (共20 μL)：10 μL SYBR Primix Ex TaqTM，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，用ddH2O补足至20 μL；RT-PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40循环，在65 ℃延伸步骤收集荧光信号后，采用2-ΔΔCT进行相对定量分析。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，BOX Chemi XR凝胶成像仪(Syngene 英国)拍照分析。

1.8 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性测定

根据PEPC催化原理，在Mg2+存在下，PEPC把磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-催化形成草酰乙酸。草酰乙酸和NADH在苹果酸脱氢酶的作用下形成苹果酸和NAD+。通过测定340 nm下NADH的氧化速率可计算出PEPC活性大小。分别取不同生长时期的铁皮石斛叶片0.1 g，用Tris-HCl缓冲液和叶片混合于冰浴中研磨，在4 ℃下8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。反应体系：1 mL 100 mmol·L-1Tris-HCl，内含100 mmol·L-1MgCl2，pH 9.2，0.1 mL 40 mmol·L-1PEP，0.1 mL 5 mmol·L-1NADH，过量的苹果酸脱氢酶，0.1 mL酶液，0.1 mL 100 mmol·L-1NaHCO3启动液，1.5 mL蒸馏水，反应液总体积为3 mL，在25 ℃下保温10 min，在340 nm处测定吸光值，每隔10 s测定吸光值，记录吸光值的变化。酶活力定义为：在测定条件下，每分钟内每毫升酶液氧化1 μmol NADH为一个酶活单位(μmol·mL-1·min-1)。

表1 RT-PCR引物信息

1.9 试验数据处理与统计分析

应用统计分析软件SPSS 17.0进行数据统计分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同处理组间的差异，显著性水平设定在α=0.05，采用Origin 8.6软件绘图。

2 结果与分析

2.1 OM真菌对铁皮石斛生长的影响

OM真菌对铁皮石斛生长具有显著的促进作用，铁皮石斛组培苗接种OM真菌后生长比对照组旺盛，苗色浓绿，产生新根多。由表2可知，接种OM真菌后，株高、根重、茎叶重和总生物量均显著高于对照组(P<0.05)，其中株高、根重、茎叶重和总生物量分别是未接种对照组的1.21、1.54、1.71和1.68倍。

2.2 OM真菌对铁皮石斛叶片叶绿素含量的影响

光合色素是植物进行光合作用所必需的物质，其含量高低在一定程度上反映了植物叶片光合作用的强弱。从表3可以看出，OM真菌对铁皮石斛叶片中叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量影响显著(P<0.05)，对类胡萝卜素含量和叶绿素a/b值影响不显著。可见，接种OM真菌能显著提高铁皮石斛幼苗叶绿素含量，提高叶片光合作用，促进铁皮石斛幼苗的生长。

2.3 OM真菌对铁皮石斛植株光合特性的影响

由表4可知，接种OM真菌显著提高了铁皮石斛叶片的Pn、Gs和Tr，但对Ci影响不显著。由光响应曲线(图1，A)可知，随着光照强度的增大，铁皮石斛的Pn由负值开始不断上升，随后，Pn开始下降。在光照强度处于50～800 μmol·m-2·s-1之间时，接种OM真菌的铁皮石斛叶片始终具有较大的净光合速率，在光强为300 μmol·m-2·s-1时，净光合速率达到最大，而未接种组在光强为200 μmol·m-2·s-1时，净光合速率最大。说明接种OM真菌增强了铁皮石斛对光强的适应性。由二氧化碳响应曲线(图1，B)可知，随着CO2浓度的升高，其所对应的Pn快速上升，在CO2浓度达到400 μmol·m-2·s-1左右时，Pn达到最大，并随着CO2浓度的继续升高缓慢下降。OM真菌对二氧化碳响应曲线影响不显著，说明OM真菌不影响铁皮石斛对环境CO2的需求。

表2 OM真菌处理下铁皮石斛幼苗生长情况

注：表中各列的不同字母表示0.05水平差异显著；-M. 未接种OM真菌(对照)；+M. 接种OM真菌；下同

Note：The same column normal letters in table are significantly different among treatments at 0.05 level; -M. Non-inoculated OM fungi (control); +M. Inoculated OM fungi; The same as below

表3 OM真菌处理下铁皮石斛叶绿素和类胡萝卜素含量变化

表4 OM真菌处理下铁皮石斛叶片光合参数变化

图1 OM真菌处理下铁皮石斛叶片的Pn-PAR响应曲线 (A)和Pn-CO2 响应曲线(B)Fig.1 Response curve of the net photosynthetic rate to different photosynthetic photon flux densities (A) and different concentrations of CO2 (B) in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

2.4 OM真菌对铁皮石斛植株叶绿素荧光参数的影响

从表5可以看出，OM真菌能提高铁皮石斛Fm、Fv/Fm和Fv/F0的值，提高了铁皮石斛PSⅡ原初光能转化效率和PSⅡ反应中心潜在活性，能把所捕获的光能高效转化为植物所需的化学能。

图2表示qP、qN、Yield和ETR等荧光参数对光照强度的响应。由图2，A可知，qN随着光强的增大而增大，而qP随着光强的增大而降低(图2，B)，接种OM真菌均能提高qP和qN的值，进而提高铁皮石斛PSⅡ将所捕获的光能转化为化学能的效率，增强了铁皮石斛耗散过剩的光能为热的能力，提高光合机构的自身保护能力。图2，C显示，Yield随光强的增大而降低，在同一光量子通量下，接种OM真菌的铁皮石斛的Yield较高，而对照组较低，这与上述光化学猝灭系数的结果相对应，说明OM真菌提高了PSⅡ光能捕获效率。ETR随光强变化曲线如图2，D所示，在低光强下，接种OM真菌与对照组铁皮石斛的ETR无明显差异，当光强超过100 μmol·m-2·s-1时，随着光强的增加，接种OM真菌的铁皮石斛的ETR增加更快，在光强为600 μmol·m-2·s-1时，对照组受到抑制开始下降，而接种OM真菌组在800 μmol·m-2·s-1时，才受到抑制。可见，接种OM真菌能提高铁皮石斛的ETR值，激发铁皮石斛潜在的光合能力。

表5 OM真菌处理下铁皮石斛叶片部分叶绿素荧光参数比较

图2 OM真菌处理下铁皮石斛叶片叶绿素荧光参数比较Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence parameters in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

2.5 OM真菌对pepc基因表达的影响

铁皮石斛是CAM植物，由PEPC催化固定CO2形成苹果酸。因此pepc基因表达量的高低对铁皮石斛光合速率具有重要影响，对铁皮石斛的生长起着决定作用。图3表示了铁皮石斛叶片不同生长时期pepc基因的表达情况，由图3可知，在铁皮石斛幼苗生长1个月时，接种菌根真菌和对照组pepc基因表达量差异不大，随着培养时间的延长，接种OM真菌的叶片pepc基因表达量显著高于对照组，说明OM真菌能促进pepc基因的表达。由图4可知，接种OM真菌显著提高了PEPC活性，接种OM真菌植株的PEPC活性变化与接种OM真菌植株的pepc基因表达变化一致，研究表明，OM真菌通过诱导pepc基因的表达提高PEPC的活性，进而提高铁皮石斛叶片光合碳同化能力。

图3 OM真菌处理下铁皮石斛pepc基因的表达Fig.3 Expression of pepc gene in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

图4 OM真菌处理下铁皮石斛叶片PEPC活性变化Fig.4 The changes of PEPC activity in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatments

3 讨 论

光合作用是植物生长的基础，是植物体内重要的生理代谢过程，光合作用的强弱对植物的生长具有重要影响。植物的光合作用受到各种环境因素的影响，如植物受到菌根真菌侵染时，叶片中叶绿素含量、Pn、Gs和Tr均会发生变化，从而影响植物的光合作用[17]。在植物与真菌共生过程中，真菌通过提高植物的光合效率，促进碳水化合物的积累来满足真菌对碳源的需求[18]。叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其含量高低反映了植物光合能力的大小[19]。本研究结果表明，接种OM真菌能提高铁皮石斛叶片中叶绿素含量，叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率，但Ci变化不明显。OM真菌能够促进叶绿素的合成，提高铁皮石斛的光合能力。叶片气孔导度升高有利于气体和水分交换，是植物光合作用控制因素之一。铁皮石斛属于CAM植物，其光合碳同化途径在CAM和C3途径间转换，强光照射会导致叶片气孔关闭，影响气体交换。在接种OM真菌情况下，铁皮石斛叶片Gs升高，但Ci并未降低，导致Gs升高的原因可能与菌根的形成促进了水分的运转有关，从而有利于菌根苗气体交换[20]，促进CO2的吸收，使Ci保持在一定水平，提高植物的光合作用。

叶绿素荧光来自光反应系统(PSⅡ)的天线色素，叶绿素荧光的变化反映了植物的光合生理状况以及多种因素对植物光合作用的影响。如干旱[21]和铝[22]胁迫降低了植物叶片的叶绿素荧光参数，影响了植物光合性能。菌根真菌能提高植株叶片的叶绿素荧光参数，改善植物光合性能。如杜鹃花菌根真菌能显著提高叶片叶绿素荧光参数，改善杜鹃花幼苗的光合性能，促进杜鹃花幼苗的生长[23]。本研究也表明，铁皮石斛幼苗接种菌根真菌后，叶绿素荧光参数有所提高，这与上述前人研究相似。Fv/Fm和Fv/F0值提高，说明PSⅡ的实际光能捕获效率较高，能把所捕获的光能更多地用于光化学反应，增强了植株对有效光的利用，提高植物叶片的净光合速率。qP、Yield和ETR升高有利于提高植物的光能转化效率以及对强光的适应性，为暗反应的光合碳同化积累更多的能量，促进碳同化的高效运转和有机物的积累[24-25]。qN提高，表明叶片PSⅡ天线色素吸收的光能以热的形式耗散掉的部分较多，对提高自身光合机构的保护具有积极作用，增强了铁皮石斛对环境的适应能力。

铁皮石斛属于CAM植物，随着环境条件的变化，其光合作用在CAM和C3途径间变化[26]。PEPC是催化CAM代谢途径中固定CO2反应的关键酶，因此，pepc基因高表达能提高植株的光合效率。本研究显示，接种OM真菌能促进pepc基因的表达，提高PEPC的活性，促进光合碳同化。叶片中高PEPC活性可以引起气孔保卫细胞中苹果酸浓度的升高，促进气孔张开，提高叶片光合速率[27]，这也可能是Gs升高的一个原因。铁皮石斛属于喜阴植物，一般不耐强光照射，光响应曲线分析表明，OM真菌增强了铁皮石斛对光强的耐受性，这可能与pepc基因表达提高了植株对光强耐受性有关[28]，具体机制还需进一步研究。

总之，接种OM真菌改善了铁皮石斛的光合性能，促进了pepc基因的表达，增强了PEPC活性，提高了铁皮石斛叶片固定CO2的能力，促进铁皮石斛生长，提高了铁皮石斛对环境的适应能力。本研究初步确定了OM真菌对铁皮石斛光合作用的影响，阐明了铁皮石斛pepc基因的表达特性以及PEPC活性变化规律，为铁皮石斛的菌根化栽培提供了依据。