丹参线粒体和叶绿体微卫星标记开发及多样性分析

沙秀芬，彭 芳，陶 珊，吴 宇，刘继明，张 超，李 群*

(1 四川师范大学 生命科学学院，成都 610101；2 四川省农业科学院 经济作物育种栽培研究所，成都 610300；3 国家中药材产业技术体系成都试验站,成都 610300；4 彭州市农林局，成都 611942)

丹参(Salviamiltiorrhiza)属唇形科鼠尾草属植物，主要产于河北、四川、山西、陕西、山东、河南等地，其根和根茎可入药，具有活血祛瘀，凉血消痈，养血安神等效用，为妇科用药，主治子宫出血、月经不调、血瘀、腹痛、经痛、经闭、庙痛，属于中国传统大宗中药材。目前以丹参为主的复方丹参注射液、复方丹参滴丸、复方丹参片等多种复方制剂，被临床上广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞和心脑血管系统疾病[1]的治疗。同时，丹参还具有抗肿瘤[2-3]、抗菌抗炎[4]、保护器官[5]等作用，是临床应用最广泛的药材之一。

近年来，不少学者运用不同的分子标记方法对丹参主要产区的种质资源进行了遗传多样性研究，结果表明不同产地的丹参个体遗传多样性丰富，但各地遗传特性不一致。郭宝林等[6]运用RAPD分子标记对中国主产区的9个丹参居群样本进行遗传多样性研究，结果显示，丹参居群内具有丰富的遗传多样性且不同地区间存在差异；宋振巧等[7]利用EST-SSR分子标记对4个产地的80个丹参种质资源进行了多样性水平分析和聚类分析，证明EST-SSR可有效检测丹参的遗传多样性，但其遗传距离与地理位置未达显著相关性；Zhang等[8]利用ISSR标记分析了不同形态丹参种质的遗传多样性，结果显示不同形态丹参材料间存在较高的遗传多样性。相对于以上的标记，SSR(simple sequence repeat)标记是由1～6 bp核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，因具有共显性遗传、多态性信息含量丰富、物种间转移性好、可重复性好和操作性简便等优点，已被广泛应用于遗传多样性的研究，王海等[9]采用丹参叶绿体基因的SSR分子标记分析了全国31个不同丹参居群的遗传特性，认为丹参的遗传变异以种群间为主导，丹参种质间存在广泛的基因交流，并建议保护道地产区的种质特性。但是，目前已开发的适用于丹参叶绿体和线粒体基因组的SSR标记较少。因此本研究利用丹参叶绿体和线粒体基因组开发SSR标记，并对61份丹参进行遗传多样性和近缘物种通用性分析。

1 材料和方法

1.1 材 料

所有试验材料均种植于四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所(表1)。每个材料取1～2片幼嫩叶片，冷冻于-80 ℃冰箱中备用。然后，下载唇形科全部的叶绿体、线粒体基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/?report=5#!/organelles/Labiatae)，用于电子PCR(Electronic PCR，e-PCR)生物信息学跨物种分析。

1.2 方 法

1.2.1基因组DNA的提取参照文献[10]的CTAB方法并稍加修改(65 ℃水浴45 min；加150 μL ddH2O溶DNA)提取DNA。提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度，将合格的DNA样品稀释至50 ng/μL用于SSR反应。

1.2.2SSR位点的搜索及引物设计使用MISA软件(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)搜索SSR位点。设置搜索参数用于检测单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR基序，分别至少重复10、6、5、5、5和5次。使用Primer3软件对SSR位点进行引物设计。基于以下参数设计引物组：GC含量40%～60%，Tm 50～60 ℃，引物长度20～24 bp，预期扩增产物长度100～250 bp。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3SSR引物的筛选为筛选出扩增效率好的cpSSR、mtSSR引物，选择10个DNA样品，用设计的SSR引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL(Mix 10 μL，引物2 μL，ddH2O 6 μL，模板DNA 2 μL)。反应程序设置：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.4SSR标记的验证筛选出多态性好的引物用61份丹参样品进行PCR扩增，PCR扩增产物用毛细管电泳进行检测。PCR反应体系为20 μL(DNA模板2 μL、引物2 μL(稀释400倍)、dNTP 2 μL(稀释4倍)、ddH2O 12 μL、Buffer 2 μL、Taq酶0.2 μL)。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.5数据分析毛细管凝胶电泳图结果有条带记为1，无条带记为0。利用NTSYS-pc2.1软件进行UPGMA聚类构建树形图。利用POPGENE1.31软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s信息指数(I)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)等多样性指标。用PIC_CALC软件分析多态性含量(PIC)。利用e-PCR进行SSR的跨物种性分析。

2 结果与分析

2.1 丹参cpSSR和mtSSR重复基元特征分析

使用MISA软件搜索丹参线粒体、叶绿体基因组序列的SSR位点，共获得32个cpSSR位点，24个mtSSR位点，不同核苷酸重复基元的SSR数量间存在明显差异(表2)。其中，单核苷酸重复基元A/T的mtSSR位点共17个，占mtSSR位点总数的70.8%；二核苷酸重复基元(AG/CT、AT/AT)和三核苷酸重复基元(AAG/CTT、AAT/ATT)，分别占mtSSR位点总数的12.5%和16.7%。而cpSSR位点的单核苷酸重复基元A/T，占cpSSR位点总数的96.9%，二核苷酸重复基元AT/AT，占mtSSR总数的3.1%。没有筛选出全部由G/C碱基构成的SSR位点。

2.2 引物的筛选

为了初步筛选出SSR引物，用56对引物在10个DNA样品中进行扩增，结果(图1)显示，34对引物能在7个以上的样品中成功扩增出条带，具有较高的稳定性和多态性，能够用于SSR标记的验证。将筛选出的34对引物对61份丹参样品进行PCR扩增，PCR产物用毛细管电泳检测筛选出23对扩增效果好、位点数量适中的cpSSR和mtSSR引物，进一步用于丹参遗传多样性分析，结果(表3)发现，其中19个SSR位点出现在丹参叶绿体基因组和线粒体基因组的非编码区UTR区域，4个SSR位点出现在CDS编码区，分别是引物cp21p、cp26p、mt4p和mt21p。

2.3 丹参遗传多样性分析

2.3.1SSR标记多态性分析用筛选的23对引物对61个样本进行PCR扩增，共检测到23个位点，均为多态性位点，多态百分比率为100%(表4)。每一对引物检测到观察等位基因数为2，有效等位基因数范围为1.103～1.987，平均值为1.566。引物cp25p最多，为1.987，其次是引物mt6p和cp5p，有效等位基因数均为1.913，引物mt9p有效等位基因数最少，为1.103。

在群体遗传多样性分析中(表4)，观测杂合度(Ho)在0.499～0.906之间，平均为0.654，引物mt9p最高，cp25p最低；期望杂合度(He)在0.094～0.501之间，平均为0.346，引物cp25p最高，mt9p最低；Shannon’s指数(I)为0.196～0.690，平均为0.519，引物cp25p最高，mt9p最低。标记的多态信息含量(PIC)介于0.089～0.373，平均为0.278。其中0.250

表2 丹参中不同SSR重复基序的量

M. DNA markerⅠ；10份材料编号同表1图1 引物cp25p、cp29p、cp30p对10份材料的扩增结果M. DNA markerⅠ; The 10 variety codes were the same as in Table 1Fig.1 Amplification effect of primer cp25p, cp29p, cp30p on 10 materials

引物名称Primer name 重复基序Repeat motif引物序列Primer sequence (5'→3')退火温度Tm/℃扩增产物长度Amplification product length/bp基因组中位置Genomic locationcp1p(A)10F:TAGCCGCACTTAAAAGCCGAR:TCCATTCATTTTTCTGTTTCGAATTCA56.952.5232(trnK-UUU)-rps16基因间区 Intergeniccp2p(A)11F:AATGATCCGGGGCGTAATCCR:CCCTCTCTTTCCGTTTCCGT57.757.3213atpA-atpF基因间区 Intergeniccp5p(A)10(A)15F:GGCTCTCACGCTCAATTCCTR:CGGCGACCTATGCCTTATGT57.757.5243(trnG-UCC)-(trnfM-CAU)基因间区 Intergeniccp8p(T)11F:CGGTGGTATCAAAACGCCACR:TTCATTCCCGAGGAAGTGCA57.156.5234rps4-(trnT-UGU)基因间区 Intergeniccp10p(A)11F:ACCTTTGCGTCTTCCTTGGAR:CAGTCCCGACGGATCCAATA56.756.7240psbM-(trnD-GUC)基因间区 Intergeniccp11p(A)15F:GGAGAAGATGCGGGTTCGATR:CCTTGAGGTCACGGGTTCAA57.557.6247rps8-rpl14基因间区 Intergeniccp21p(T)13F:ATTTGACCTCGTATCCGGCGR:CCCTCGGTTGATCTTGGTTGA57.757.3122rpoC2cp25p(T)10F:GTCAAATACATGAATGAAGGAAAAGGAR:CGTTAGCCCATACTGCTCCA52.757.2181rps4-(trnT-UGU)基因间区 Intergeniccp26p(T)10F:GACTTTGATTCGCGGCACTCR:CGTTTCCAAAGAGGTTCGTTGT57.155.6118clpPcp30p(T)11F:AATCAAGCCACGACCCTCACR:CGGTTACCGGTCTCAATAATTGA57.954.4209ndhG-ndhI基因间区 Intergenicmt2p(A)11F:AAAGCCCCGCACCTCATTAAR:CTGGCTGGGAGCTGTATGAG57.158.2161orf117a-mttB基因间区 Intergenicmt4p(A)10F:TCCTTCCACCGGCCCTTATAR:TCAACGGTTCTTCGGCCTAC58.157.5227orf154amt6p(T)10F:GCAGCACACCAGACGAAAAGR:GTTCAGGAGCTCCTTGCGTA57.357.3242orf137-(trnQ-UUG)基因间区 Intergenicmt7p(A)10F:CCGAATGAATATCCCGCGGAR:CCGCCTTTTTGCCAACATCA57.656.8194atp4-(trnI-CAU)基因间区 Intergenicmt9p(T)11(A)11F:GAACGGTCGGTAGCTGCTTAR:CTCGTAGTACCTGCTAGCGC57.358.0142orf117a-mttB基因间区 Intergenicmt11p(T)10F:GCCCTTCAACCACCTCATCTR:TCTATCGAGACATTGCGGGC57.657.5238orf182b-orf119a基因间区 Intergenicmt12p(TA)6F:GCGTTGGTACCACGCTCTATR:AGCTATACCACCAGTCTGTTTTCT57.655.2237orf154amt13p(TA)7F:GAAAGGGCCGCTTGCTTAAAR: GGAAAGAGGAGGCCTTTGCT56.357.8192ccmC-rpl2基因间区 Intergenicmt14p(TTC)5F:GCGTTGTTGGGTGGAATTCCR:TCCAAACCTCCTCTTCCCCA57.558.3177orf99c-orf139基因间区 Intergenicmt16p(A)10F:TCTAACCGATCCGCCCAGTAR:ACGATCCTGTCTCAGAGGCT57.957.9243atp6-orf103a基因间区 Intergenicmt19p(A)10F:CAGAGCGAGTCGAAGTGTGTR:CGTAACTGAGCGGTGGACTT57.457.5216orf103b-orf108b基因间区 Intergenicmt21p(A)10F:GAAGAGTGCACGTCCGAAGAR:ACCTACGTCATTCGACTCGC57.457.2232orf105-nad7基因间区 Intergenicmt22p(T)11F:CGGACCCTCGATTCGATTGTR:GCTGCAAGACCAAAACAGGG57.457.5121ccmB-rpl10基因间区 Intergenic

2.3.2聚类分析运用NTSYS-pc2.1软件对61份丹参进行聚类分析。结果(图2)显示，在相似性系数为0.54处可分为两大类群，四川省中江县7号材料独立聚为第一大类群；剩余的丹参聚为第二大类群。第二大类群在0.64处又可分为6个亚群，分为亚群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。四川省、陕西省、山东省和9份中间材料聚在第Ⅰ亚群；安徽省、山西省和中间材料16号聚在亚群Ⅱ；四川省中江县5号小叶丹参单独聚为Ⅳ亚群。由图2可见，四川丹参在5个亚群中均有，说明四川丹参的遗传多样性丰富，而且同一个省的丹参分布在不同的类群中，表明丹参药材遗传变异与地理分布无明显相关性，这说明丹参产区之间的遗传分化不明显。

2.4 cpSSR和mtSSR标记在鼠尾草属种间的通用性

利用13对mtSSR和10对cpSSR标记分别对丹参、墨西哥鼠尾草(S.leucantha)和康定鼠尾草(S.prattii)等进行PCR扩增。结果(表5)显示：11对mtSSR标记和9对cpSSR标记能在3种以上的植物中扩增出清晰的条带。11对mtSSR引物在9种鼠尾草属中的平均通用性比率为64.63%，通用性较高；9对cpSSR引物在10种鼠尾草属中的平均通用性比率为44.66%，通用性较低。

表4 23对mtSSR和cpSSR标记的遗传参数

61份材料编号同表1图2 基于遗传距离的61份丹参资源聚类图 The 61 variety codes were the same as in Table 1Fig.2 Cluster diagram of 61 accessions of S. miltiorrhiza based on genetic distance

2.5 cpSSR标记在野芝麻亚科植物属间的通用性

将10对cpSSR引物分别在22条基因组序列中用电子PCR进行分析，结果(表6)发现，引物cp5p、cp8p和cp10p分别在3个属4条基因组序列、8个属21条基因组序列和6个属12条基因组序列生成特异性产物，表明这3对引物在野芝麻亚科植物属间的通用性较好。

3 讨 论

3.1 61份丹参品种间的亲缘关系

通过聚类分析发现，采集的61份丹参的遗传相似性系数为0.54～0.96。山东32号和四川中江49号，中间材料47号和四川中江52号品种，遗传距离最小，相似性系数最大。此外，来源于四川中江、山东和安徽的丹参聚在Ⅰ、Ⅱ亚群，说明四川中江、山东和安徽地区的丹参亲缘关系较近，具有很大的相似性，可能是因为四川中江丹参的种植主要采用根段无性繁殖方式栽培，在栽培过程中引来了外来种源，不同地区进行种质互换、基因交流等引起的。9份中间材料聚在Ⅰ亚群，可能它们母本之间亲缘关系较近；而5号四川中江小叶丹参品种形成了相对独立的亚群，小叶丹参经产地长期选根留种，形成了具有适应性强、耐旱、亩产量高等优势的稳定遗传因子，且在长期栽培过程中和其他产地丹参品种间基因交流较少所致。总体看，四川丹参出现在绝大部分亚群中，说明四川丹参仍保留着较为丰富的遗传多样性。为保护四川丹参资源的多样性，提高四川丹参的质量，急需对四川丹参资源进行系统收集评价，为生产提供更加优质的种源。

表5 mtSSR和cpSSR引物在鼠尾草属种间的扩增结果

注: -. 表示鼠尾草没有用mtSSR来检测

Note：-. Indicates thatSalviais not detected with mtSSR

表6 cpSSR引物在野芝麻亚科植物属间的扩增结果

3.2 遗传多样性分析

遗传多样性是物种生存适应和发展进化的前提，对环境变化适应能力越强的物种，其遗传多样性越高或遗传变异越丰富；反之，容易受到环境变化影响的物种其遗传多样性较低[11]。期望杂合度(He)被认为是衡量一个物种遗传多样性水平高低的标准，本研究结果表明丹参的期望杂合度为0.346，高于双子叶植物的平均水平(He=0.190)，多态信息含量在0.089～0.373之间，平均值为0.278，Shannon’s指数平均值为0.519，说明所收集的丹参种质资源呈中等水平的遗传多样性。与王海[9]、宋杰[12]、Hyejin An[13]等研究丹参遗传多样性的结果是一致的。本研究开发的23对SSR引物在丹参中具有较高的多态性，说明mtSSR和cpSSR引物对丹参具有良好的鉴别能力，可以作为品种鉴定的一个辅助工具。

3.3 cpSSR和mtSSR标记的通用性

近年，人们对葫芦科[14]、虎耳草科[15]、蜡梅科[16]、松科[17]、禾本科[18]、豆科[19]、茄科[20]、菊科[21]、葡萄科[22]及蔷薇科[23]等近缘物种间通用性进行了大量研究，并且开发了一定数目通用SSR标记，这些标记可以为遗传学和基因组学等方面的研究提供更多的遗传信息[24]。本研究所选用的11对mtSSR标记在鼠尾草属通用性比率为64.63%，比宗成堃[25]利用EST-SSR标记在唇形科鼠尾草属通用性分析结果高，表明丹参mtSSR在鼠尾草属中有较好的通用性。而9对cpSSR在唇形科鼠尾草属通用性比率为44.66%，低于宗成堃的研究结果。显然，mtSSR和cpSSR引物在鼠尾草属内较高的可转移性极大地减轻了引物开发的工作量，同时为研究种间进化关系提供了一条有效途径。