黑果枸杞LrTTG1基因的克隆及表达分析

马得森，王联星，史国民，何 涛

(青海大学 生态环境工程学院，青海省园林植物与观赏园艺重点实验室，省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016)

花青素(Anthocyanins)属于类黄酮物质，是一种水溶性天然色素，可以使植物呈现多种颜色[1]。它广泛存在于植物中，最常见的有6类，分别是飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、锦葵色素、芍药色素和牵牛花色素[2]。随着对花青素不断深入的研究，人们发现其拥有抗氧化[3]、改善肝功能[4]、降血糖[5]、抗癌[6]、抗炎[7]、防辐射[8]和保护视力[9]等多种生理作用。因此，花青素被广泛应用到食品、保健品和医药等领域，有着很好的前景。

TTG1 (TRANSPARENTTESTAGLABRA1)基因编码的蛋白一般含有WD40重复基序，所以被称为WD40蛋白，该调控因子与花青素的合成[10]、根毛发育[11]、表皮毛发育[12]和种子休眠[13]等密切相关。目前，已先后从拟南芥(Arabidopsisthaliana)[14]、棉花(Gossypiumhirsutum)[15]、油菜(Brassicanapus)[16]、紫罗兰(Matthiolaincana)[17]、茄子(Solanummelongena)[18]等多种植物中克隆出该基因。其中，有学者[12]发现拟南芥ttg1-13突变体表现出无花青素的特性。Humphries等[15]克隆出了棉花GhTTG1基因并发现该基因能够弥补拟南芥ttg1突变体中无花青素的缺陷。Lu等[16]发现油菜的BnTTG1在各个组织器官中都有表达，跟拟南芥AtTTG1基因的组织表达模式相同，推测其可能在油菜种皮色素的形成中有重要的调控作用。在紫罗兰TTG1蛋白氨基酸链中的一个色氨酸突变为精氨酸，导致DFR(Dihydroflavonol-4-Reductase)不表达，花青素合成受阻，所开的花为白花[17]。刘新宇等[18]发现在茄子中SmTTG1参与花青素的合成。

黑果枸杞的果实中含有丰富的花青素，是蓝莓的18倍之多。但是黑果枸杞LrTTG1基因与花青素的关系还不是很清楚，为此，本研究以黑果枸杞为材料，采用RT-PCR和RACE相结合的方法，分离黑果枸杞TTG1基因，探讨了该基因在不同组织及紫外胁迫下的表达特性，为进一步研究该基因的功能奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料及处理

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)种子和组织采自柴达木盆地东沿都兰县境内的诺木洪农场，其中青果为开花后15 d、紫果为开花后22 d、黑果为开花后30 d。

选取培养60 d的种子苗，按照师生波等[19]的方法进行紫外胁迫处理，分别于处理后1、3、6、9和12 h取叶片为材料。

1.2 方 法

1.2.1黑果枸杞LrTTG1基因的克隆根据 NCBI上已克隆到的其他植物TTG1序列设计简并引物Primer-F1(5′-ATGGA(A/T/G)AATTCAA-GTCAAGAATC-3′)、Primer-R1(5′-TTATACTTTAAGCAGCTGCAACTTG-3′)。取黑果枸杞叶片，按照MiniBest Universal RNA Extraction Kit操作流程，提取总RNA，并反转录成cDNA。以Primer-F1/R1为引物，使用EXTaq酶进行扩增获得LrTTG1基因的中间保守序列，将克隆获得的序列连接至pMD®19-T载体上进行测序。根据已得到的中间序列设计3-RACE的外侧引物3′-GPS-1(5′-GACGATTATTTATGAGTCCCCACAA-3′)、内侧引物3′-GPS-2(5-ATGGGATTGATCCTATGTCGATGTA-3′)和5′-RACE的外侧引物5′-GPS-1(5′-GAGTTTAGTAGGTGGATAAGGGTG-3′)、内侧引物5′-GPS-2(5′-GGCGGTTATTGAGTGAAG-GG-3′)。按照TaKaRa公司的SMARTer®RACE 5′-/3′-Kit说明书进行PCR扩增反应，PCR扩增产物连接至pMD®19-T载体上进行测序。根据3个片段拼接成的LrTTG1基因cDNA序列设计引物LrTTG1F (5′-CACTTCCATTTTCCCCTCA-3′)、LrTTG1R (5′-CACCTTCAAGCAGTCCAAAA-3′)进行Confirm PCR扩增试验，PCR扩增产物连接至pMD®19-T载体上进行测序。

1.2.2黑果枸杞LrTTG1基因的生物信息学分析通过ORF Finder寻找开放阅读框；使用DNAMAN 6.0和NCBI上的Blast进行同源比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)并利用MEGA5.0构建系统发育树；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白质的理化性质；采用SOPMA(http://pbil.ibcp.fr)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对氨基酸的二、三级结构进行预测。利用在线软件NCBI CDD预测LrTTG1蛋白的保守域；通过PSORT(http://psort.nibb.ac.jp)在线软件进行亚细胞定位预测。

1.2.3花青素含量检测花青素提取和测定参考邵文婷等的pH示差法[20]。

1.2.4LrTTG1基因的表达分析以黑果枸杞茎、叶、花、青果、紫果、黑果和紫外处理不同时间下的叶片cDNA为模板，内参基因为β-Actin，内参引物为β-Actin-F(5′-TATTTCAAGGTCAAGATACCT-3)、β-Actin-R (5′-GAGTCAATCCCATTAGGCCC-3′)，LrTTG1实时荧光定量引物为Rt-TTG1-F (5′-CCCACAACCTGATACTCCGT-3′)和Rt-TTG1-R(5′-TGCAACAGTAGGCAACTCCC-3′)。按照SYBR Premix ExTaqⅡ说明书进行qRT-PCR，PCR反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，38个循环，95 ℃ 10 s。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞LrTTG1基因的克隆

如图1所示，获得保守片段约1 000 bp(图1)，3′-RACE片段约500 bp(图1)，5′-RACE片段约100 bp(图1)，gDNA片段约1 000 bp(图1),将中间片段、3′-端和5′-端目的片段进行拼接，在开放阅读框区域外设计引物，进行Confirm扩增验证，得到预期的片段(图1)，最终得到1条全长为1 453 bp的完整黑果枸杞LrTTG1基因的cDNA序列。它包含1 029 bp的开放阅读框、71 bp的5′-UTR和353 bp的3′-UTR，其中包括17 bp的polyA。将其命名为LrTTG1，GenBank登录号为MH633481。黑果枸杞LrTTG1基因组DNA序列与cDNA序列比对结果表明，该基因序列中不包含内含子。

2.2 黑果枸杞LrTTG1基因的生物信息学分析

通过ORF Finder发现LrTTG1的长度为1 029

bp，编码342个氨基酸(图2)，理论分子量为38.302 1 kDa，等电点为4.95；将LrTTG1推导的氨基酸序列与其他植物TTG1转录因子氨基酸序列进行比对，并构建进化树(图3)，发现LrTTG1与茄子SmTTG1(KP006501.1)进化距离最近，相似性高达83.73%，与黄瓜、马铃薯等茄科植物均有较高的序列相似度。与云杉PaTTG1(KU131225.1)的进化关系相对较远，相似性为58.4%。通过DNAman6.0比对不同植物的TTG1氨基酸序列如图4所示，多重对比显示它们的氨基酸相似性比较高。SOPM软件分析结果显示，LrTTG1蛋白二级结构中α螺旋(alpha helix)结构占9.36%，β转角(beta turn)结构占4.09%，无规则卷曲(random coil)结构占51.75%，延伸带(extended strand)结构占34.80%(图5，A)。LrTTG1蛋白三级结构如图5，B。利用在线软件NCBI CDD预测LrTTG1蛋白的保守域，结果表明LrTTG1属于WD40超家族。亚细胞定位预测表明，LrTTG1蛋白定位于细胞核的可能性为69.6%，符合转录因子的亚细胞定位特征。

*.终止密码子；阴影部分为TTG1蛋白的5个保守功能域图2 黑果枸杞LrTTG1cDNA全长及其编码序列 *.Termination codon; The shaded regions are 5 conservative functional domains of TTG1 proteinFig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LrTTG1

M. DL2000; 1. 保守片段Conserved region; 2. 3′-RACE; 3. 5′-RACE; 4. Confirm; 5. gDNA图1 黑果枸杞LrTTG1基因的克隆Fig.1 Amplification of LrTTG1 gene in Lycium ruthenicum

图3 TTG1系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of TTG1

SmTTG1. 茄子(KP006501.1)；StTTG1. 马铃薯(JX848661.1)；CsTTG1. 黄瓜(NM001280758.1)；LrTTG1. 黑果枸杞图4 TTG1蛋白多序列比对 SmTTG1.Solanum melongena；StTTG1.Solanum tuberosum；CsTTG1.Cucumis sativus；LrTTG1.L. ruthenicumFig.4 Multiple sequence alignment result of TTG1

不同小写字母表示在0.05水平上差异显著,下同图6 不同组织花青素含量 Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level; the same as blowFig.6 Anthocyanin content in different tissues

图7 不同组织LrTTG1基因表达水平Fig.7 Analysis on expression of LrTTG1 gene in different tissues

2.3 不同组织中黑果枸杞LrTTG1基因表达水平及花青素含量检测

检测不同组织中的花青素含量，发现黑果中的花青素含量最高(11.3 mg/g)，显著高于其他组织；叶中的花青素含量最低为0.1 mg/g(图6)；从不同成熟度果实花青素的含量来看，越成熟的果实中其花青素含量越高。

检测不同组织中的LrTTG1表达水平，发现LrTTG1基因在检测组织中均有表达，且青果中表达量最高，约为黑果中的4倍，而黑果中的表达量最低(图7)。这表明LrTTG1基因存在组织表达特异性且在果实发育的前期(0～15 d)发挥重要作用。

2.4 黑果枸杞LrTTG1基因受紫外胁迫后的表达水平分析

如图8所示，随着紫外胁迫时间的延长，在黑果枸杞种苗叶片中LrTTG1基因的表达趋势呈现先下降后上升趋势，在1 和3 h显著降低分别是对照组的0.94和0.96倍，在6 h表达量最低约是对照组的0.93倍；9 h后开始恢复到对照组基因表达水平。综合来看，黑果枸杞LrTTG1基因能够响应紫外辐射。

图8 LrTTG1基因在紫外胁迫下的表达分析Fig.8 Expression analysis of LrTTG1 gene under UV irradiation

3 讨 论

本研究从黑果枸杞中克隆得到LrTTG1基因，序列分析表明，LrTTG1基因编码的蛋白属WD40型转录因子。WD40型转录因子已被证明广泛参与调控植物花青素的生物合成。在玉米(Zeamays)中，其中1个WD40型转录因子基因pac1缺失可导致a1、bz1和c2这些花色素苷结构基因的表达下调，在种子的糊粉层没有花青素的积累，但是种皮的花青素合成并不受到影响，而ttg1能充分互补pac1功能[21-22]。在拟南界芥ttg1突变体中花青素的合成受到影响，说明TTG1蛋白参与花青素合成调控过程[10]。刘凯歌等[23]发现在突变体ttg1-13背景下，异源表达甘蓝型油菜BnTTG1-1基因能够完全恢复该突变体不能合成花青素的缺陷。同源性分析表明，LrTTG1蛋白与茄子SmTTG1蛋白在同一分支上，进化关系最近。茄子SmTTG1基因被证实参与调控花青素的合成[18]，推测黑果枸杞LrTTG1基因可能具有类似的生物功能。

本研究发现，随着黑果枸杞果实的发育，LrTTG1基因的表达量呈现下降趋势，而花青素的含量则呈上升趋势，两者呈负相关关系。Takada等[24]在烟草中过表达甜瓜乙烯受体的突变基因(Cm-ETRI/H69A)，结果使得花瓣中的花青素含量增加，从而证明乙烯负调控花青素相关基因的表达。高树林等[25]发现乙烯处理对花青素合成的结构基因和调节基因的表达有抑制作用。推测LrTTG1基因在果实发育中的表达量下降可能与乙烯相关，成熟果实中的乙烯含量往往更高，它们抑制了LrTTG1基因的表达。为了研究LrTTG1基因与紫外辐射之间的关系，对黑果枸杞种苗进行了紫外胁迫处理，LrTTG1基因的表达量呈现先下降后上升的趋势，在1、3和6 h的表达量与对照组相比存在显著性差异。姚攀锋[26]对苦荞进行了紫外胁迫，发现FtWD40基因响应紫外胁迫，表明FtWD40可能参与了花青素的合成。强维亚等[27]对高山植物歪头菜(ViciaunijugaA.Br.)进行了紫外照射，发现其内源激素先升高后下降。Ma等[28]发现不同的环境因素或激素对花青素合成相关基因有促进或抑制的作用。以上研究说明花青素合成相关基因能响应紫外胁迫，紫外胁迫可改变植物体内激素含量，从而抑制花青素合成相关基因的表达，这可能是黑果枸杞LrTTG1基因在紫外胁迫下表达量下降的原因之一。

本研究克隆了黑果枸杞LrTTG1基因，并对该基因在不同组织中以及紫外处理后的表达模式进行了分析，推测出LrTTG1基因在黑果枸杞花青素代谢的调控中起一定作用。后续将继续研究该基因与其他花青素生物合成途径相关关键酶基因及激素的关系，进而全面解析其参与黑果枸杞花青素代谢调控的分子机制。