人脐静脉内皮细胞培养技术的研究进展

白雪晶，冯 磊，徐文波,罗 旋，鄢东海(.昆明医科大学第六附属医院，云南省玉溪市人民医院，云南 玉溪 65300；.昆明医科大学，云南 昆明 650500)

血管内皮细胞连续覆在血管内膜，其具有重要的生理功能，广泛参与了炎性反应、血管新生、免疫应答、动脉粥样硬化、血管张力调节等生理及病理过程[1]。血管内皮细胞功能失调与许多心血管疾病的发生有关，冠心病的发生与血管内皮细胞的损伤与其功能异常有密切的关系[2]。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法，是目前最简单可靠的被广泛运用于生理研究的人类血管细胞。随着细胞培养技术不断进步，文献报道了一种仪器，使用这种仪器内，皮细胞可以从人类的脐静脉中分离出来而不受污染[3]。但是作为基础实验，笔者仍然需要探索一种适用于科研工作者的分离纯化HUVECs的方法。

1973年Jaffe等首先报道了内皮细胞体外培养的方法[4]，以后人们在此基础上不断完善和改进，以获得性状稳定、纯度较高的血管内皮细胞，并可较长时间培养(可传6～10 代)，内皮细胞的体外培养关键在于获取、纯化。作为HUVECs培养的第一步，细胞的获取方法对细胞纯度及含量至关重要，在培养细胞的获取方法上,有酶法和非酶法两种。

1 细胞获取方式

1.1非酶法：非酶法主要包括机械刮取、组织块移植两种。但是机械刮取方法易损伤细胞，组织块移植易混杂其他血管壁细胞，近几年来这两种方法已较少使用。

1.2酶消化法：这种方法的主要步骤是用酶灌注脐静脉，收集内皮细胞后接种培养。每一个过程都影响着HUVECs的纯度和活力。消化时间是关系到内皮细胞活力和纯度的重要步骤，消化时间过长，易混入其他杂细胞，导致内皮细胞自脐静脉脱离后在培养液中较难存活，使细胞纯度和细胞活力都下降；反之,消化时间过短,则获取的细胞较少，经过大量研究，消化时间为10～15 min较为理想[5]。而酶是成功的关键步骤，早期探索了三种酶处理脐静脉、分离内皮细胞的方法，不同实验研究表明，不同的酶有不同的优势，用胶原酶消化的细胞数最多,平均每根脐带可获取(2～5)×106个细胞,但有时混杂少量成纤维细胞；链丝菌蛋白酶消化获取的细胞数略少于胶原酶,但很少混杂成纤维细胞；胰蛋白酶对细胞有毒性作用,且消化获取的细胞数较少,不利于细胞生长[6]。

目前常用的酶主要是胰蛋白酶和胶原酶。大多数实验采用的是胰蛋白酶，因为胰蛋白酶较胶原酶价廉易得，能获得的细胞数量较多，成活率也较高。刘文等研究表明胰酶消化法能够获得大量且纯度高的HUVECs[7]。近几年国内外的研究者也常选用胶原酶，包括Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，Ⅰ型胶原酶运用较广泛，运用Ⅱ型胶原酶也能成功获取足量细胞。罗锐等通过实验得出结论，他们发现选用Ⅰ型胶原酶作为血管内皮细胞分离酶，与其他酶(胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶)相比，消化效率适当，细胞量较多，结构较为完整，且细胞成团生长，容易存活[8]；但是陈小翠等人采用Ⅱ型胶原酶灌注消化人脐静脉，也获得了高纯度、高活性的脐静脉内皮细胞[9]。也有研究表明，Ⅰ型胶原酶消化分离获得的HUVECs纯度高、活力强,而胰蛋白酶消化分离HUVECs可以降低非内皮细胞的贴壁能力，因此,二者混合消化是一种经济且实用的获取HUVECs的方法[10]。

2 脐静脉内皮细胞的培养

HUVECs 是一种低增殖能力的细胞，体外生长能力较差，增殖缓慢，因此人脐静脉内皮细胞的原代培养要注意以下几点：内皮细胞通常需要加入高浓度(20%)的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement，ECGS)才能满足其生长需要。目前，较常用的培养基是M199培养基，含有10%～20%的FBS及ECGS，但是BalaK等人的研究发现[11]，在含高浓度FBS( 200ml/L) 的M199培养基中添加内皮细胞生长因子仍不能满足脐静脉内皮细胞生长需求，而且这种培养基还存在一些问题，如由于血清浓度过高，细胞容易老化，传代的代数较少，不利于后续实验的进展，同时FBS中含有各种不同含量的生长因子，是否需要加入的生长因子以及加入的量难以把握[12]。也有研究通过加入一定浓度的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)或碱性成纤维因子( basic fibroblast growth factor，bFGF)[13]来促进血管内皮细胞的增殖，但是生长因子价格昂贵，难以推广使用。而且加入细胞因子对于继续研究可能有干扰作用，在冠心病形成诸多的参与因子中，VEGFs和bFGF等因子是调节新生血管成熟的重要生长因子，李海云等人的研究表明，冠心病心肌缺血越严重，血清VEGF的含量越高[14]；也有研究表明，人血清中bFGF增高可能是冠心病发生的新型风险因子[15]，而人脐静脉内皮细胞最常用于心脑血管疾病的研究，这容易对实验结果产生影响，所以经过不断探索，最近许多研究使用内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM),其成分固定,且FBS浓度仅为5%，ECGS为1%。这种培养基培养的原代内皮细胞形态好，死细胞较少，且传代后贴壁率高，ECM 培养基能够选择性的促进人微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态[16]。另外，细胞培养在原代、传代时营养液一般都需要添加血清，选择高质量的血清是细胞培养成功的关键，较常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、人血清等，目前较常用的是胎牛血清。

3 脐静脉内皮细胞的鉴定

不同器官和组织起源的内皮细胞在细胞形态、基因表达、表型和功能特性等方面都不相同，鉴别内皮细胞的方法有多种，主要是依据显微镜下形态学特征、特异性抗原的表达来鉴别的。

3.1形态学观察：倒置相差显微镜可以初步鉴别，研究发现[17-18]，脐静脉内皮细胞贴壁单层生长,初为圆形、椭圆性或团块状，后逐渐呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形，边界清楚，胞核清晰可见，呈圆形或椭圆形。HE 染色胞核呈蓝色、卵圆形，位于中央，大而不规则，可见明显的核仁，胞质均匀，胞质呈粉红色，胞膜较清楚，胞浆丰富。根据培养条件的差异，细胞贴壁的时间稍有差别，接种数小时(2～6 h不等，多为2～3 h)后开始贴壁，1 d左右贴壁完全，1～2周左右可汇合成片；传代细胞生长旺盛，通常1 h左右开始贴壁，3～7 d可汇合成片，细胞分布均匀，边界清楚，细胞核有时呈双核或多核[19]。

3.2免疫组织化学染色：仅依靠形态学来鉴别内皮细胞是不够准确的，可结合细胞免疫化学法来鉴定内皮细胞，Ⅷ因子是血管内皮细胞的特征性标志之一，目前鉴定HUVECs最有效的方法是检测Ⅷ因子相关抗原。Ⅷ因子的稳定性和半衰期取决于VWF(von Willebrand factor)，因此VWF相关抗原免疫组化可以用来鉴定HUVECs，该方法简单易行。通常采用兔抗人或鼠抗人作为一抗，二抗的来源广泛，常用酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG)，经过染色后，显微镜下观察摄片，阳性反应可见内皮细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆内可见棕黄色颗粒，核周密集。有研究发现[20]，Ⅷ因子连同VWF共同储存在weibel- palade body(W-P小体)中,W-P小体等特异性物质可以进行鉴定，透射电镜下内皮细胞核膜清晰,胞浆内多微丝、微管结构,在少数细胞核周的胞浆可见内皮细胞所特有的杆状小体W-P小体，其为质膜包裹,内有微管样结构。但不是所有细胞都有W-P小体，因此不能作为常规鉴定的标志物。

还有其他化学染色法可以鉴别内皮细胞，但是不常用于HUVECs的鉴定，分泌一氧化氮是内皮细胞的重要功能，Western blotting检测内皮细胞标志酶-一氧化氮合酶的含量也可以用来鉴定内皮细胞，但是由于这些方法检测的是内皮细胞的共性，对于鉴别HUVECs特异性不高，不能作为常规检测方法。早期有研究采用抗VWF因子抗体免疫荧光标记对HUVECs进行鉴定，摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和吸附Ⅰ型荆豆凝集素(UEA-1)的细胞功能检测也被用做特异性的鉴定内皮细胞的方法，刘长乐等人实验结果显示[21]：Dil-Ac-LDL(荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白)发红色荧光，荧光强度高；FITC-UEA-1(异硫氰酸荧光素标记的Ⅰ型荆豆凝集素)发绿色荧光，荧光强度高；双荧光阳性百分比较高；胞核呈蓝色荧光，有可参考性。

3.3细胞纯度检测：鉴定内皮细胞表型常用的抗原标记包括CD34、CD144。有研究表明，自从Fina等发现血管内皮细胞有CD34的基因表达[22]后,常被用来标记血管内皮细胞，CD34表达强于Ⅷ因子，它被认为是目前血管内皮细胞最可靠的标记，可进行免疫组织化学染色，但目前较常用的是流式细胞术，流式细胞术。CD144为内皮细胞特异性标志，常用检测方法有免疫细胞化学法、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测及Western blot检测法。张清等实验结果显示[23]CD144免疫细胞化学阳性细胞，染色表现为细胞膜附着棕黄色颗粒；反转录-聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞目的基因CD144有较强表达；Western blot检测传代的人脐静脉内皮细胞，显示高表达CD144。

近年来也有人用CD31[24]、sCD54[25]、CD105、 VEGFR[26]来对内皮细胞进行鉴定。VWF、Ⅰ型荆豆凝集素(UEA-1)结合率也可用流式细胞仪来检测，以鉴定内皮细胞的纯度。

3.4细胞增殖检测：MTT法 人脐静脉内皮细胞增殖能力可以反应细胞的活力，在一定时间内，随着培养时间增加，内皮细胞明显增殖加快，有实验结果表明[27]，HUVECs接种后1 d细胞计数略有减少，2 d开始生长，但生长速度较慢；3～7 d生长速度加快,维持在对数生长期；8 d起细胞发生接触抑制，进入停滞期，细胞倍增时间为72 h。

3.5冻存后复苏后管腔形成实验：冻存后 HUVECs仍然具有成管能力，管腔结构的完整性，管腔大小以及管腔壁厚度与冻存前细胞所形成的管腔无明显差别。有实验结果显示，在内皮细胞专用培养基培养条件下，HUVECs 呈较好的运动和分化状态，培养24 h后在细胞外基质胶 Matrigel 上可见类似于毛细血管的完整闭合管腔形成[12]，说明冻存后细胞仍能维持内皮细胞的功能，标准冻存后对 HUVECs的功能无明显影响。

4 展望

随着高血压，冠心病等血管性疾病发病率增高，与血管内皮细胞功能的研究成为热点，目前体外培养的HUVECs是最重要也是最常见的研究心血管疾病的工具细胞，包括原代HUVECs和HUVECs细胞株两种，HUVECs细胞株种类比较多，多数是与癌细胞杂交获得的，培养要求低，可以无限传代。一般用于心血管疾病研究的是ECV304、EA.hy926。相对于HUVECs细胞株，原代细胞培养要求较高，但是由于其材料易于获得，所获得的实验结果较符合人体情况，生物学特性更典型，易于鉴别，有利于后续实验研究，研究者可以根据自身实验要求进行选择。

与动物细胞相比，HUVECs 更接近人体生理状态；而与人体动脉内皮细胞相比，HUVECs 取材经济、操作简便，且具有与动脉内皮细胞生物学特征相似的优点，运用更加广泛，为进一步研究血管内皮细胞的生物学特性以及其与各种疾病的关系奠定了基础。本文总结了脐静脉内皮细胞培养常见的分离、培养、鉴别方法，但是目前仍然存在一些问题，目前已经经过了多种探究，但是仍然没有统一的可实施的标准，还需要不断探索，总结出一套使HUVECs培养效率高、纯度好，且简单易行，能稳定地运用于血管相关疾病研究的细胞培养方法。

5 参考文献

[1] Siow R C.Culture of human endothelial cells from umbilical veins[J].Methods MolBiol，2012，806:265.

[2] 李红昆，陆永光.内皮细胞微粒与冠心病关系的研究进展[J].广西医学，2013，35(1):104.

[3] Lei J，Peng S，Samuel S B，et al.A simple and biosafe method for isolation of human umbilical vein endothelial cells[J]. Analytical Biochemistry，2016，508:15.

[4] Jaffe E A，Nachman R L，Becker C G，et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria[J].Journal of Clinical Investigation，1973，52(11):2745.

[5] Qin Y X，Wu Z M，Xu Q，et al.Effects of serum starvation on cell cycle synchronization in primary human umbilical vein endothelial cells[J].Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University，2016，36(8):1140.

[6] 卞杰勇,周 岱.人脐静脉内皮细胞体外培养的影响因素[J].中国细胞生物学学报，1997,19(2):66.

[7] 刘 文，陈瑞云，王志伟.原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结[J].中国医学工程，2016，26(8):11.

[8] 罗 锐，胡如印，汪 健,等.原代人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定[J].中华临床医师杂志:电子版，2016，(11):14.

[9] 陈小翠，陈邦党，杨毅宁,等.人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32(3):328.

[10] 刘洋洋，冉林武，范学文,等.人原代脐静脉内皮细胞体外模型的建立及鉴定[J].宁夏医科大学学报，2016，38(2):223.

[11] Bala K，Ambwani K，Gohil N K.Effect of different mitogens and serum concentration on HUVEC morphology and characteristics：implication on use of higher passage cells[J].Tissue & Cell，2011，43(4):216.

[12] 蔡维霞，梁 亮,计 鹏,等.人脐静脉血管内皮细胞体外培养的方法研究[J].中国修复重建外科杂志，2011,25(2):139.

[13] Kitamura N，Hasebe T，Matsumoto T，et al.Basic fibroblast growth factor as a potential stent coating material inducing endothelial cell proliferation[J].Journal of Atherosclerosis & Thrombosis，2014，21(5):477.

[14] 李海云，逄锦聚.冠心病患者血清BNP、VEGF、hs-CRP检测的价值评估及研究[J].中外医疗，2017，36(21):29.

[15] Ivannikova E V，Kalashnikov V Y，Smirnova O M，et al.Risk factors and glycation end products in patients with different forms of coronary heart disease and type 2 diabetes mellitus[J].Ter Arkh，2014，87(10):19.

[16] Du P，Subbiah R，Park J H，et al.Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment[J].Tissue Engineering Part A，2014，20(17-18):2365.

[17] 崔丽丽，余芳芳，左 丽,等.改良人原代脐静脉内皮细胞的分离及鉴定[J].贵阳医学院学报，2015，40(1):20.

[18] 马振华，张连杰，马艳琴.人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2015，35(3):285.

[19] Turner N A，Moake J L.Factor VIII Is Synthesized in Human Endothelial Cells，Packaged in Weibel-Palade Bodies and Secreted Bound to ULVWF Strings[J].Plos One，2015，10(10):e0140740.

[20] 阎江洪，吴倩怡，罗素新,等.人脐静脉内皮细胞原代培养及鉴定[J].新疆医科大学学报，2016，39(5):555.

[21] 刘长乐，郑心田，李广平,等.体外人脐静脉内皮细胞的培养鉴定及抗原表达分析[J].山东医药，2011，51(36):25.

[22] Fina L，Molgaard H V，Robertson D，et al.Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells[J].Blood，1990，75(12):2417.

[23] 张 清，张玲玲.人脐静脉内皮细胞体外培养及其相关研究[J].医学综述，2010，16(3):333.

[24] Suhaila R N，Safuan S，Suhaila R N，et al.Isolation Methods and Culture Conditions of Human Umbilical Vein Endothelial Cells from Malaysian Women[J].Sains Malaysiana，2017，46(3):463.

[25] Malara N M，Trunzo V，Musolino G，et al.Soluble CD54 induces human endothelial cells ex vivo expansion useful for cardiovascular regeneration and tissue engineering application[J]. International Journal of Cardiology Heart & Vasculature，2015，6:48.

[26] Zeng R，Jiang X F，Chen Y C，et al.VEGF，not VEGFR2，is associated with the angiogenesis effect of mini-TyrRS/mini-TrpRS in human umbilical vein endothelial cells in hypoxia[J]. Cytotechnology，2014，66(4):655.

[27] 李 悦，杨向红.生长抑制因子4对内皮细胞增殖、迁移及血管形成相关因子表达的影响[J].中国医科大学学报，2017，46(2):160.