禽流感荧光PCR快速检测方法的应用

2018-02-13张明敬

畜牧兽医科技信息 2018年5期

张明敬，史慧

（江苏省连云港市畜牧兽医站，江苏连云港 222001）

随着经济的发展，人们对食品的需求量越来越高，大量的养殖禽畜被送往动物检疫处，以往的检测方法耗时长，运行成本高，无法应付逐日递增的工作量。比如鸡胚病毒分离法，大概需要3周时间才能出检疫结果，大大降低了检疫处的工作效率。荧光PCR自上个世界90年代末发展起来后，逐渐被应用于禽流感的日常监测中，荧光PCR比普通PCR的敏感度高约10倍，可最大程度检测禽畜中的微量病毒。

1 检测样品

本文从当地的各大屠宰场进行取样，分别取普通鸡肉10份、鸡喉或泄殖腔拭子10份、鸡鸭血清各10份、鸡内脏10份。为了避免在取样过程中发生污染，样本用灭菌棉拭子粘取后放入加有PBS的灭菌小离心管中，对样本的采集均使用灭菌剪、灭菌刀，采集后将取得的样本置于2～8℃，如果在24h后不能被检测，则应置于-50℃的环境中保存。

2 试剂

试剂包括通用荧光RT-PCR试剂盒、RNA提取液、禽流感病毒H5、H7、H9亚型荧光RT-PCR 试剂盒、DEPC水、Taq酶、反转录酶、异丙醇以及 75%乙醇、生理盐水。

3 仪器

主要仪器有分析天平、荧光PCR扩增仪、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器、BioBard Chrom4型荧光PCR仪、台式高速冷冻离心机

3.1 试验方法

3.1.1 样本处理每份样品分别处理。首先，组织样品处理，每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g左右，使用手术剪剪碎后取0.02g置于研磨器中研磨至均匀的粉状，加入1.5mL生理盐水继续研磨，直至研磨成均匀浆糊状后再转至1.5mL离心管中，8000转速离心2min，取上清液100μL置于1.5mL灭菌离心管中。其次，进行阴阳对照处理，分别取100μL对照置于1.5mL灭菌离心管中。

3.1.2 病毒RNA的提取（1）取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，静置三到五分钟。（2）将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时被堵塞住），13000转速离心30s。（3）扔掉收集管中废液，加入600μL洗液，13000转速离心30s，此步骤做完后重复一遍，保证收集管中的杂质被洗涤干净。（4）扔掉收集管中的废液，13000转速空柱离心2min，彻底去除残留的洗涤液。（5）将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向吸附柱中央加入洗脱液50μL，静置1min，13000转速离心30s，此时离心管中生成的液体就是我们需要的RNA模板。

3.1.3 实时荧光RT-PCR操作设被检样品、阴阳对照总和为N，则试剂反应体系配制基本如下：无菌无核酸酶水2.7（N+1）μL、RT-PCR 反应液 10（N+1）μL、酶混合液 0.4（N+1）μL、荧光探针1.9（N+1）μL。将以上配制的反应体系充分混合均匀后，分装每个反应管中各15μL。

分别取5μL模板RNA，加入相应反应管中，均匀并做好标记，在荧光PCR仪上进行以下反应：45℃ 15min，95℃1min该循环一次；95℃5s，60℃ 35s该循环40次。

3.2 试验结果

整体检测的结果与真实结果相吻合，首先阳性对照的Ct值小于30时报告的曲线图有明显的增长期，阴性并无明显的增长曲线，被检测的样本Ct值大于30时，需重复检测一次，如果数值仍有仍大于30，基本可将样本判定为阴性，整个报告不存在假阳性或假阴性现象。

2006 年以前，我们掌握的禽流感检测技术主要以血凝抑制试验进行免疫抗体水平检测为主，采用普通的PCR检测技术也能完成禽流感的检测，但是随着后来“企业自检、官方抽测”原则的实施，检疫处推广使用了科学、健康、快速的荧光PCR，这种方式的优点显著，但同时也要注意配套措施和监督的作用，为了提高荧光PCR的检测效率，要做到以下几方面，首先工作人员要严格操作，多利用通风设备，避免样本对仪器的污染。