石蜡切片的制作及其免疫组化染色技术

温 蕾，陈肇源，陈桂霞，袁镜乐

（1.东莞市厚街镇农业技术服务中心，广东 东莞 523960；2.东莞市万江农业技术服务中心，广东 东莞 523050）

随着兽医临床诊断技术快速发展，动物传染病的诊断经常采用准确快速的PCR、荧光PCR等分子生物学方法、血清学检测方法等；但是，若想更直观详细地了解病理、确定病情发展进程，组织切片技术往往是必不可少的。根据不同的制作工艺，组织切片技术可分为石蜡切片和冰冻切；其中石蜡切片具有直观性、可保存时间长、成本低廉、运用范围广等优点，在疾病诊断、病理学研究等方面的运用尤其成熟，是兽医诊断中是最权威的诊断方法之一。因此，本文将对石蜡切片的制作及其免疫荧光染色技术作一简要概述。

1 制作石蜡切片

石蜡切片，将获得的新鲜动物组织迅速经二甲苯固定，经过脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片等步骤以获得5～10μm的组织薄片，后经苏木精染色、HE染色、免疫组化和免疫荧光染色等方法，获得相应数据。

1.1 固 定 根据组织的特点将其纵切成小块，使被检测部位包含在组织块之中。4%多聚甲醛固定，放置水平摇床慢摇24h。

1.2 脱 水 自来水洗涤3次，0.5h；30%、50%、75%、85%及95%乙醇溶液逐级脱水0.5h；最后无水乙醇脱水3次，共3h。

1.3 透 明 二甲苯与无水乙醇1：1，15min；二甲苯，10～15min；二甲苯 10～15min。

1.4 浸 蜡 已经透明的组织块浸入石蜡，1h；纯石蜡，2h～4h。

1.5 包 埋 （1）将组织块切面朝下，平放入手工小纸盒，加满石蜡进行包埋；（2）再将纸盒放在冰水中冷却以促进蜡块凝固；（3）包埋好的组织块室温或4℃保存半年以上。

1.6 其他步骤 冷却好的蜡块最后通过切片、展片、捞片、烤片的步骤得到5～10μm厚度的切片标本放入37℃烘箱内保存，用于后期染色和免疫组化等检测。

2 切片的免疫组化染色

免疫组化，基本原理是抗原抗体反应，通过标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位的检测技术；其优点在于通过荧光抗体或DAB染色可清晰地显示出所检测抗原（抗体）的阳性区域，特异性强、灵敏度高，与ELISA等检测方法相比成本低廉；病理切片常用于疾病的确诊。

2.1 具体步骤

脱蜡：二甲苯 5～8min×3 次；二甲苯无水乙醇溶液（1：1），3min；无水乙醇3min×2次；95%、85%、75%、50%、30%乙醇溶液逐级浸泡3min；蒸馏水，2min。免疫组化染色：按照免疫组化过程进行抗原修复、阻断、孵育一抗、清洗、孵育二抗（带荧光标记或化学DAB试剂）1～2h，清洗、封片、镜检和拍照。

2.2 数据分析 利用光密度分析软件对病理图片进行分析得出数据，并通过Graphpad Prism 5软件进行数据整理作图及统计学检验，t检验分析组间差异，p＜0.05具有显著性的统计学意义。

3 技术讨论

3.1 石蜡切片制作常见问题和关键因素

（1）石蜡切片对组织取材的专业性要求高，不同组织其韧性不同，组织块切割大小方位不一。不新鲜的组织因细胞破裂或结构不清，都会导致切片制作失败。（2）固定、脱水和透明步骤要针对不同组织制定不同方案，操作者对石蜡切片质量影响很大，不熟练的操作通常会造成裂片、断片、组织结构不完整等问题，这通常发生在切片和展片、捞片过程中。（3）切片染色期间也要特别注意抗体配比和染色时间的控制，背景太深、着色太浅将影响切片病理观察及半定量数据分析。（4）每张切片制作完成都是一个独立的实验，及时记录有助于实验改进，关键因素有：组织新鲜与否、固定是否及时，脱水彻底与否，透明是否合适，脱蜡是否彻底。（5）制作高质量的石蜡切片要求操作者有严谨的科学态度和良好的主观能动性，把握步骤、时间、温度、试剂浓度等基本要素，提前实验计划，合理安排实验进度。（6）环境温度、湿度、季节等也会影响切片质量。

3.2 石蜡切片染色效果比较

免疫组化的DAB染色的应用极广，灵敏度最高，染色时间较短，切片染色效果保存时间最长，常用于单一变量的分析上；相对DAB染色，石蜡切片的荧光染色成本略高，能更加形象地展现细胞的病理区域，而且可以同时呈现细胞的两种或两种以上抗体的定位，在细胞骨架成分在细胞上的分布、磷酸化程度和自噬活动等方面的研究应用上有明显优势，较DAB染色假阳性少。