重庆地区HBV基因型群体遗传学研究*

李 甜，覃 英，胡 渝（重庆市人民医院400014）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球分布趋势，是世界性公共卫生疾病之一，也是危害中国公共卫生健康的疾病重要之一[1]。本研究中，通过对重庆市HBV病毒情况进行群体遗传学分析，探讨重庆地区HBV病毒的群体遗传多样性，进一步判断重庆市HBV群体扩张趋势，最终预测重庆地区HBV病毒爆发的风险。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择重庆市范围内8个不同的区（黔江区、万州区、南川区、涪陵区、北碚区、垫江县、合川区和沙坪坝区），收集HBV感染患者的血清，患者入院时间为2014年1—12月，患者户籍为重庆且长期居住在重庆，排除标准为患有其他类型肝炎。血清分离后使用干冰运输，保存在−80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 使用E−CyclerTM 96聚合酶链反应（PCR）扩增仪（北京博奥生物有限公司）。由上海PerkinElmer提供磁珠法提取HBV DNA试剂盒。德国Qiagen公司提供PCR扩增试剂。华大基因提供PCR引物（10µmol/L），引物序列如下：5′−GCGGGGTTTTTCTTGTTGA−3′，5−GGGACTCAAGATGTTGTACAG−3′。

1.2.2 研究方法

1.2.2.1 标本处理及检测 使用上海铂金埃尔默生物科技有限公司试剂盒（磁珠法）进行提取。PCR扩增条件为：95℃ 预变性10 min；95℃变性30 s，52℃复性45 s，72℃延伸90 s，共40个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物由华大基因测序。

1.2.2.2 HBV 群体遗传学分析 使用MEGA6.0软件计算碱基组成、保守及变异碱基位点等[2]。使用DNAspv5.0软件[3]计算单倍型多肽性（h）、单倍型数量（hap）和核苷酸多肽性（p）。使用软件DNAspv5.0计算Fu's Fs值及Tajima's D值，并构建错配分布。若HBV有效种群保持稳定，则核酸的错配分布曲线呈现出多峰曲线分布，同时Fu's Fs和Tajima D值检验不显著。若群体经历过扩张，则核酸的错配分布曲线呈单峰倒钟形分布[4]，Fu's Fs中性检验和Tajima D值同时偏离中性突变。使用软件BEAST v1.7.1分析群体增长时间和扩张情况，分析各地区各基因型贝叶斯轮廓图（BSP）。B和C基因型的平均进化速度分别定义为：（7.72±5.00）×10−4位点/年，（3.73±2.10）×10−4位点/年[5-6]。使用 10 000 000代蒙特卡罗（MCMC），对每1 000代进行抽样，计算得到10 001棵系统发育树。比较分析MCMC的log文件与系统发育树。使用Tracer 1.5软件分析群体的有效大小[采用95%最大后验密度（HPD）]和扩张时间，并生成贝叶斯轮廓图[7]。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，定量资料以表示，采用t检验计数资料以表示，采用χ2检验比较计数数据间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBV系统发育结果 把HBVS基因所测序列与A-H型参考序列[8]（来自NCBI）进行比对，剔除比对不能满足要求的前后各一段序列，最终B型碱基数量为531bp的序列长度用于系统发育分析。B型基因组成为A（19.2%）、T（31.8%）、C（27.9%）、G（21.1%）。C型碱基长度525 bp，组成为A（18.1%）、T（31.9%）、C（28.6%）、G（21.4%）。比对后B基因型的变异位点、保守位点、自裔位点和简约信息位点分别为189、339、66、123个。C基因型包括变异位点、保守位点、自裔位点和简约信息位点分别为189、339、66、123个。用本研究获得的528个HBV S基因序列及A-H型的参考序列（从NCBI网站上获得）构建得到系统发育树。进化树上各节点上的数值为自展分析值，发育可信时自展分析值大于90%。用Kimura 2-parameter模型计算并以碱基替换为单位来决定树枝长短，以推断树的进化距离。本研究中所得的基因序列主要构建分为B、C和D基因型，3个基因型自展分析值均大于90%。

2.2 HBV群体遗传学结果 B型的HBV序列共有346条，并含有250个单体型；C型HBV序列共有181条，包含163个单体型。各地区分布表1所示。各地区C型的核苷酸多态性（π）和单倍型多态性（h）均比B型的更高。（见表1）。

3 讨 论

分子遗传学是以核酸序列变异为基础，以研究群体遗传结构，以及群体遗传结构与其影响因素的相互关系为研究目的。其主要衡量指标是基因同源序列的遗传分化程度。群体遗传结构主要影响因素包括基因重组、基因突变、基因转换等。群体遗传学研究一般是运用软件分析群体基因及基因型频率等数据，并构建相关模型[9]。

在中国，HBV主要为B和C型[10−12]。本课题组的前期研究证实垫江地区的HBV感染者B型和C型HBV有效种群大小在过去5年中经历过一次较大的扩张，提示HBV在该地区爆发的风险非常大[13]；在另一项使用类似研究方法的研究表明，柳州地区HBV扩张速度较为缓慢[14]。本研究中，通过对HBV进行群体遗传学分析，分析重庆地区HBV不同群体的遗传多样性，从而判断重庆地区HBV群体扩张情况，最终判断HBV爆发的风险。

本研究中样本来自重庆8个地区中528个HBV感染血清中HBV S基因序列，并对群体遗传多样性及遗传结构进行分析。结果显示，346个B型S基因样本中含有189个突变位点和250个单倍型（hap）。单倍型多态性（h）0.978，分布范围0.895～0.999。核苷酸多态性（π）0.016 44，分布范围0.026 28～0.006 94。181个C型S基因样本中共150个突变位点、163个单倍型，h为0.999，分布范围0.992～1.000；核苷酸多态性为0.020 51，分布范围0.017 88～0.026 04。单倍型多态性和单倍型越高，表明群体遗传多样性丰富及种群越大，其生存能力也更强。本研究中HBV B型和C型单倍型多态性和单倍型均高，且C型高于B型，表明C型具有更强的生存能力。

为了分析HBV群体扩张的情况，作者使用了多种研究工具，包括Fu's Fs中性检验法、核苷酸错配分布、BSP及Tajima's D中性检验法，从而多角度分析。Fu's Fs中性检验法主要反应的是种群的近期事件。若Fu's Fs值的负值增大，表明种群近期突变累积较多。种群的古老突变主要使用Tajima's D中性检验法显示，Tajima's D值对种群事件反应较长。虽然HBV属于DNA病毒，但逆转录酶校正功能缺乏，因而其比RNA病毒进化速度更快。有研究表明，HBV的进化速度为7.72×104位点/年[7]，高于人类T细胞白血病病毒[15]，高速进化的结果导致HBV感染宿主后高速扩张。BSP分析结果显示，重庆地区HBV B型与C型10年中曾经发生过快速扩张，甚至某些地区扩张达到10倍。仅少部分地区（黔江区、合川区、沙坪坝区）的HBV C型扩张不明显。HBV B与C基因型均呈典型倒钟形分布，沙坪坝区、合川区及黔江区呈现多峰分布。加上Tajima's D值及Fu's Fs值结果均显示为负值，且Fu's Fs值的趋势远远大于Tajima's D值，提示HBV种群扩张主要发生在近期，与BSP分析结果一致。目前，重庆市区域内HBV种群扩张的原因仍然不明确。BSP图分析显示扩张时间发生在2008年后，因而推测2008年汶川大地震一个非常可能的原因。例如，灾民的迁移及地震治疗不及时，均有可能导致HBV群体的扩张。本研究结果显示，HBV群体有效种群大小呈现继续扩张的趋势，因此建议重庆地区对HBV感染控制方面采取更多、更有效的措施，并有必要组织大型的分子流行病学研究，并对HBV的爆发做好预警工作。