池塘环境中异育银鲫鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)的检测与传播途径分析

高敏敏， 税典章， 吴 萍， 叶元土， 吴 韬， 何冬成， 陈 卓， 崔振华

(1.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州 215123； 2.无锡三智生物科技有限公司，江苏无锡 214000；3.华辰水产有限公司，江苏盐城 224000； 4.林华水产有限公司，江苏盐城 224000)

异育银鲫鳃出血病是由鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)引发的一种危害非常大的流行性病毒性疾病。关于CyHV-2的传播途径尚不完全清楚，一种可能性是通过鱼卵、受精卵到鱼苗的纵向传播途径，另一种可能途径是通过鱼体体表黏液在鱼体之间的横向传播途径。纵向传播途径的研究需要在鱼卵、受精卵中找到CyHV-2存在和传播的路径，而横向传播则需要在鱼体体表黏液中找到CyHV-2存在的证据和传播路径。

本研究以发生异育银鲫鳃出血病的单一池塘为研究单位，以同一池塘中的不同鱼类、异育银鲫鱼体的体表黏液、鱼卵巢、水体、水体中藻类等为试验材料，采用定量PCR方法检测CyHV-2的特异性存在，评价在池塘环境条件下不同鱼体、雌性鱼体卵巢、鱼体体表黏液、浮游生物中是否携带CyHV-2，探讨CyHV-2在池塘环境中的传播途径、存在状态，以期为系统防控异育银鲫鳃出血病的发生和发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 采样池塘

选择江苏大丰的上海农场(光明渔业公司)的8号、17号池塘和大丰苇渔场的9号、18号池塘(盐城华辰水产科技有限公司)共4个池塘为试验对象，这4个池塘在2017年6月初均有疑似异育银鲫鳃出血病发生。于2017年6月23、24日分别对这4个池塘的异育银鲫、草鱼、鲢鳙鱼、野杂鱼和浮游生物进行采样，进行CyHV-2检测。

1.2 鱼体材料

鱼种类：选择池塘中异育银鲫、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、野杂鱼等种类，将鱼体在冰盘上解剖，取肝、胰、脾、肾等内脏，每尾鱼的肝脏、胰脏、脾脏、肾脏混合为1个样本，液氮速冻后带回苏州大学实验室用于检测CyHV-2。如果鲫鱼性成熟，则采集鱼卵、或精巢进行CyHV-2检测。鲫鱼体表黏液通过刮取鲫鱼体表两侧提取，液氮冷冻保存于CyHV-2检测。

1.3 浮游生物样本

取池塘饲料投喂区域、水面下30 cm水样，用80目滤网过滤，滤渣再经过3 000 r/min离心10 min，得沉淀物液氮速冻作为池塘浮游生物样本用于CyHV-2检测。

1.4 CyHV-2检测方法

以CyHV-2病毒核心序列C-2-F1和C-2-R1为引物(C-2-F1：TGGAATCAGTTCAACGCGTCAT；C-2-R1：CGTCAGTGCCTGGCAGTAATA)，提取样品组织的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物于2%琼脂糖进行凝胶电泳。电泳图谱中239 bp片段特异性条带即为CyHV-2病毒阳性。

2 结果与分析

2.1 上海农场水产养殖四区17号池塘(NC-4-17)CyHV-2检测结果

上海农场水产养殖四区17号(编号：NC-4-17)池塘面积4 hm2，鱼种放养模式为：体质量131.5 g/尾的异育银鲫 38 671尾/hm2；255 g/尾的鲢鱼836尾/hm2；体质量862 g/尾的鳙鱼896尾/hm2。鱼种放养时间为2016年2月27日。2017年6月初，异育银鲫开始发病，诊断为鳃出血病，于2017年6月25日采样，异育银鲫累计死亡约3 000尾，采样时还有鲫鱼死亡情况。以收撒网采集池塘中6尾异育鲫鱼的肝胰脾肾混合物样品、6尾异良银鲫的体表黏液；1号、4号鲫鱼为雌性(其余为雄性)，采集了卵巢样品。

由图1可知，该池塘异育银鲫发生了典型的鳃出血病，取样的1～6号异育银鲫的肝、胰、脾脏和肾混合物中在239 bp出现明显的条带，显示CyHV-2的存在，也证实了该池塘发生的疾病为异育银鲫鳃出血病。重要的是，在其黏液中检测到了CyHV-2，在1号、4号(其他为雄性个体)异育银鲫鱼卵中也检测到了CyHV-2。结果表明，对于已经发病的异育银鲫个体，其体表黏液含有CyHV-2，可以成为横向(鱼体个体之间)传播的基础，即鱼体之间通过身体黏液的接触传播CyHV-2是可能的。同时，鱼卵中CyHV-2的存在，也预示着通过鱼卵传递到受精卵中的可能性。

2.2 上海农场水产养殖一区8号池塘(NC-1-8)CyHV-2检测结果

NC-1-8池塘是1个异育银鲫鳃出血病发病池塘，在取样1～6号异育银鲫肝、胰、脾、肾的混合样品中，在239 bp出现明显的条带，显示CyHV-2的存在；同时，1～6号鲫鱼体表黏液中也检测到了CyHV-2的存在。在2、6号鲫鱼鱼卵中也检测到CyHV-2的存在。结果表明，NC-1-8池塘的异育银鲫发生了CyHV-2病，鲫鱼肝、胰、脾、肾混合样品中检测到了CyHV-2；同时，鲫鱼体表黏液中CyHV-2的存在，预示着鱼体之间横向传播CyHV-2的可能性；鱼卵中 CyHV-2 的存在预示着通过受精卵纵向传播CyHV-2的可能性。

2.3 大丰苇渔场18号池塘(DFW-18)CyHV-2检测结果

该池塘面积5.2 hm2，鱼种放养模式为：异育银鲫：体质量 8 g/尾 的鱼种20 507尾/hm2、体质量161 g/尾的鱼种 7 463尾/hm2；体质量7 g/尾的草鱼149 254尾/hm2；体质量 13 g/尾 的鲢鱼597尾/hm2；体质量18 g/尾的鳙鱼 1 239尾/hm2。鱼种放养时间为2017年3月10日，2017年6月初异育银鲫开始有少量死亡，于2017年6月24日采样，异育银鲫累计死亡1 000尾。采样时该池塘发病得到有效控制，没有再出现鲫鱼死亡情况。采集了10尾鲫鱼的肝脾肾混合物样和体表黏液；同时采集有草鱼、鲢鱼、鳙鱼、野杂鱼的肝脾肾混合样；采集浮游生物样品1个。

DFW-18池塘不同鱼种、浮游生物中CyHV-2的检测结果见图3和图4。

由图3可知，DFW-18池塘中，异育银鲫1、2、3、4、5号个体带有239 bp的CyHV-2条带，其他个体的不明显；1、4、5、6、7、8、10号鲫鱼的体表黏液有239 bp的CyHV-2条带但不明显。DFW-18池塘的异育银鲫内脏中有CyHV-2的存在，但239 bp条带的明亮程度不强；异育银鲫的体表黏液中也有CyHV-2的存在。

由图4可知，异育银鲫的卵巢、精巢中没有检测到明显的239 bp的CyHV-2特异条带。鲢鱼2号肝脾肾混合样中检测到239 bp的CyHV-2条带，而草鱼、鳙鱼和野杂鱼中没有检测到239bp的CyHV-2条带；浮游生物样中也没有检测到239 bp的CyHV-2条带。这个结果表明，在DFW-18池塘中，除了异育银鲫内脏和黏液中携带239 bp的 CyHV-2条带外，鲢鱼的个体可能有239 bp的CyHV-2条带，而其他鱼种没有239 bp的CyHV-2条带。

2.4 大丰苇渔场9号池塘(DFW-9)CyHV-2检测结果

该池塘面积9.2 hm2，鱼种放养模式为：体质量76 g/尾的异育银鲫12 716尾/hm2；体质量63 g/尾的草鱼 37 313尾/hm2；体质量455 g/尾的鲢鱼776尾/hm2；体质量556 g/尾的鳙鱼761尾/hm2。鱼种放养时间为2017年3月6日，2017年6月初异育银鲫开始有少量死亡，于2017年6月24日采样，鲫鱼累计死亡1 500尾，采样时不再有鲫鱼死亡情况。采集了10尾异育鲫鱼的肝脾肾混合物样、体表黏液和卵巢样品；同时采集浮游生物样品1个。

由图5可知，DFW-9池塘的异育银鲫检测样本中，4、9、10号鲫鱼的肝脾肾混合样中有明显的239 bp的CyHV-2条带，其他个体不明显；而1～10号鲫鱼的体表黏液中均有较为明显的239 bp CyHV-2条带。这一结果再一次证实了异育银鲫体表黏液有CyHV-2的存在。

由图6可知，在内脏和体表黏液中有CyHV-2存在的情况下，异育银鲫卵巢中没有检测到CyHV-2。池塘浮游生物中也没有检测到CyHV-2的存在。

3 讨论

笔者所在课题组前期的研究结果表明，在发生鳃出血病的异育银鲫体内存在大量的CyHV-2粒子，在血液、肝、胰、肾、脾脏等组织中均有CyHV-2粒子的存在，也观察到了CyHV-2粒子的成熟过程[1-3]。这些研究结果表明，CyHV-2是鲫鱼鳃出血病的病原体，CyHV-2的增殖导致细胞破裂、死亡，鱼体体内、尤其是鳃小片大量出血，鱼体发生过度的炎症反应。

本研究以4个发生异育银鲫鳃出血病的池塘为研究对象，对池塘中鱼体内脏、卵巢、黏液中CyHV-2的检测结果显示，在异育银鲫发生CyHV-2病后，其肝脏、胰脏、脾脏、肾脏等内脏器官组织中有CyHV-2的存在，也证实了这些池塘发生鲫鱼死亡的疾病为CyHV-2病。

在4个目标池塘中异育银鲫体表黏液中CyHV-2的检测结果显示，鲫鱼体表黏液中有CyHV-2的存在。这个结果表明，如果在体表黏液中含有CyHV-2，鱼体之间通过身体的接触，例如在摄食饲料的过程中，存在通过体表黏液传播CyHV-2的可能性。当然，本试验仅证实发病鲫鱼体表黏液中CyHV-2的存在，还不能完全证实通过体表黏液传播CyHV-2的路径、发生过程。

异育银鲫鱼卵中CyHV-2的存在，也证实了通过鱼卵、受精卵传播CyHV-2到鱼苗的可能性。当然，本研究结果仅是证实鱼卵中CyHV-2存在的客观性，这需要有更为精确的试验来证实这种纵向传播CyHV-2的路径。

在鲫鱼以外的其他种类中，仅有DFW-9池塘中鲢鱼内脏中检测到了CyHV-2存在，而在其他种类如草鱼、鳙鱼和野杂鱼中没有检测到CyHV-2。这提示通过其他种类传播CyHV-2的可能性。

对2个池塘的浮游生物进行了CyHV-2检测，均未检测

到CyHV-2的存在，显示通过浮游生物传播CyHV-2的途径可能是不存在的。

综合本试验结果表明，CyHV-2的传播途径主要还是通过鲫鱼的体表黏液进行鱼体之间进行横向传播、通过鱼卵进行纵向传播的可能性，这应该是CyHV-2在池塘中传播的主要途径。需要注意的是，本试验结果仅表明这2种传播途径的可能性，还需更为精确的试验来证实其具体的传播路径。