生物表面活性剂生产及应用的研究进展

刘伟杰， 尤琰婷， 赵若菲， 刘 聪， 孙 地， 朱静榕

(江苏师范大学生命科学学院/江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州 221116)

生物表面活性剂是指由微生物代谢产生的一种可有效降低两相界面张力的天然物质，具有特殊的“两亲性”结构。相对于化学表面活性剂，生物表面活性剂结构复杂、分子量大、临界胶束浓度一般更低，具有表面活性和稳定性较高[1-2]、低毒或无毒、可生物降解等优点[3]。因此它被广泛用于农业生产、食品、环境修复、日用化学品、石油开采等多个领域。据预测，到2018年表面活性剂的需求量全球将达到410亿美元，因此生物表面活性剂具有巨大的发展前景。本文综述了生物表面活性剂产生菌的筛选、产物活性的检测、降低生产成本的策略及其在农业和工业领域应用的研究进展，并对其未来的研究方向进行了展望。

1 生物表面活性剂种类及产生菌

根据结构特征可以把生物表面活性剂分为脂肽类和脂蛋白类、糖脂类、磷脂类和脂肪酸类、中性脂类、颗粒生物表面活性剂以及多聚物生物表面活性剂[4-5]。目前已经报道的生物表面活性剂产生菌主要有假单胞菌(Pseudomonassp.)[3]、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)[6-7]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[8]、链霉菌(Streptomycessp.)[1]、不动杆菌(Acinetobactersp.)[9-10]、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)[11]、Brevibacteriumaureum[12]等，其中Bacilluslicheniformis和Pseudomonassp.生产生物表面活性剂的研究较多，已经被商业化应用在多个领域。

1.1 生物表面活性剂产生菌的筛选

高效的筛选模型可以减少生物表面活性剂产生菌筛选的工作量。目前较为成熟的筛选模型主要有血平板法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)蓝平板法和油平板法。

1.1.1 血平板筛选法 血平板筛选法的原理基于生物表面活性剂能使红细胞发生溶血现象。如图1-A所示，形成溶血圈的菌落可以作为待选菌株进一步研究其产生生物表面活性剂的能力[13]。血平板筛选法直观，菌株生长周期短，但该方法不易灭菌，易引入杂菌，且容易产生假阳性。

1.1.2 CTAB蓝平板筛选法 CTAB蓝平板法是目前筛选生物表面活性剂产生菌较为常用的筛选模型，其原理是阴离子表面活性剂与CTAB能形成不溶性复合物，该复合物能与亚甲基蓝产生显色反应。如图1-B所示，形成蓝色晕圈的菌落可以作为待选菌株进一步研究其产生生物表面活性剂的能力，且可以通过蓝色晕圈的大小初步判断菌株产生生物表面活性剂的能力[14]。该方法不易染菌，筛选效率高，但微生物生长周期长，且限于筛选阴离子表面活性剂产生菌。

1.1.3 油平板筛选法 油平板是将食用油或原油涂布在固体培养基上制成的平板，如图1-C所示，形成明显的噬油斑的菌株说明其能产生物表面活性剂、乳化碳氢化合物[15]，从而可以筛选出产生物表面活性剂的降烃菌，该方法操作简单、高效、直观。

2 生物表面活性剂性能评价指标

生物表面活性剂的特性可以从排油活性、表面张力、乳化性、稳定性、接触角、产量等几个方面进行分析。

2.1 扩油圈活性检测

在培养皿中加入一定量的去离子水，然后加入适量的油在水表面形成稳定的油膜，在油膜中心滴加待选菌株的发酵液上清[17]，通过测定扩油圈直径的大小判断生物表面活性剂的产量[18]，也可以通过在油膜相添加不溶于水的红色苏丹红Ⅲ使扩油圈更加明显[19]。

2.2 表面张力测定

测定待测菌株发酵液的表面张力可以更加准确地分析生物表面活性剂的性能和浓度。其测定方法主要有威廉米吊片法、毛细上升法、环法、液滴分散法、泡压法和悬滴法等[20]，近年来，表面张力测定仪被普遍使用，主要包括吊环法和铂金板法。

2.3 临界胶束浓度

临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)指表面活性剂分子形成胶束的最低浓度，是分析生物表面活性剂特性的重要参数。CMC值越小，表示其增溶、乳化、湿润、去污等能力越强。当溶液达到其临界胶束浓度时，溶液的表面张力降到了最低。表面活性剂的种类、结构特征、温度、pH值等因素都会直接影响生物表面活性剂的临界胶束浓度。

CMC的测定方法：利用表面张力仪分别测定不同浓度生物表面活性剂溶液的表面张力，随着生物表面活性剂浓度的增加，溶液的表面张力逐渐下降，表面张力下降曲线的转折点对应的生物表面活性剂的浓度即为其临界胶束浓度[21]。

2.4 乳化性能检测

乳化性也是分析生物表面活性剂特性的重要参数，具体检测方法：将待测菌株发酵液上清与油等混合后充分振荡，静置后测量乳化层高度，并计算相应的乳化指数(乳化指数=乳化层高度/混合物高度)，据此评价生物表面活性剂的乳化性能[2]。

2.5 稳定性分析

稳定性检测的方法：取纯化的生物表面活性剂样品配制成其临界胶束浓度溶液，然后分别改变生物表面活性剂溶液的pH值、温度、盐浓度等理化因素，最后通过比较试验组和对照组在扩油活性、表面张力值、乳化性等方面的变化，从而分析生物表面活性剂的稳定性[1]。

2.6 接触角测量

利用接触角测定仪测接触角也是评价生物表面活性剂特性的重要指标。接触角是指在气、液、固三相交点处气-液界面切线与固-液界面线的夹角，可用来表征液体的表面张力。Al-Wahaibi等利用该方法分析菌株BacillussubtilisB30产生的生物表面活性剂对培养基表面张力的影响[2]，如图2所示，菌株B30产生的生物表面活性剂可以有效减少接触角。

3 提高生物表面活性剂产量、降低生产成本的策略

虽然生物表面活性剂具有许多化学表面活性剂无法比拟的优点，但生物表面活性剂产量低、生产成本相对较高限制了其大规模工业化应用，市场份额小。因此提高生物表面活性剂的产量和活性、降低生产成本仍然是目前研究的热点。

3.1 优化培养条件

优化目标菌株的培养条件可以有效提高生物表面活性剂的产量，优化范围主要包括营养源(碳源、氮源、碳氮比、盐离子浓度、微量元素种类和浓度等)和发酵条件(培养温度、pH值、摇床转速、接种量等)。

3.1.1 碳源优化 碳源的种类显著影响菌株所产生物表面活性剂的结构和产量，且显著影响其生产成本[22]，因此选择高效廉价的碳源显得尤为重要。大多数生物表面活性剂产生菌能利用常见的有机碳源如糖类、甘油、烷烃类、豆油等，部分Pseudomonas和Bacillus还能降解原油烃代谢产生生物表面活性剂。Xia等研究发现，假单胞菌生产鼠李糖脂的最佳碳源为豆油[23]，其他各类精化油如葵花籽油、红花籽油、橄榄油有着相似的发酵效果[24]。以糖类和油脂类作为复合碳源的研究也屡见不鲜[25]。除了作为碳源，豆油等油脂类物质在发酵过程中还能作为消泡剂和抑泡剂，避免所产泡沫对发酵的影响，提高生物表面活性剂的产量，但豆油的加入会影响后续表面活性剂的提纯。

3.1.2 氮源优化 在氮源优化方面研究最为深入的是糖脂类生物表面活性剂。硝酸盐和铵盐是2种常见的无机氮源，研究表明，硝酸盐更有利于鼠李糖脂的合成[26]，铵盐作为氮源时，微生物会代谢产生大量的H+，降低发酵液pH值，影响鼠李糖脂的积累[27]。除了无机氮源外，以酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等作为有机氮源的研究也较为常见。此外有研究表明，鼠李糖脂作为次级代谢产物其合成起始于氮源被消耗完后[26]，所以应控制好培养基中的氮源量，使其既有利于菌株生长又有利于鼠李糖脂的合成。

3.1.3 其他条件优化 盐离子能维持细胞渗透压平衡并能刺激细胞合成生物表面活性剂，但盐离子浓度过高时会影响细胞膜通透性，抑制细胞的代谢和分泌，所以发酵生产生物表面活性剂过程中盐离子浓度也是一个重要的控制参数。此外转速和装液量会影响溶氧量，温度和pH值会影响菌体内酶活和代谢物结构的稳定性，这些都是发酵条件优化过程中的重要参数。

3.2 添加促产因子

促产因子也能有效提高生物表面活性剂的产量。如氨基酸、金属离子、酵母提取物和有机酸是常见的4类促产因子。金属离子[28]和氨基酸[29]主要用来促产脂肽类生物表面活性剂，而酵母提取物[30]和有机酸[31]常用来促糖脂类生物表面活性剂的产生。Khan等研究发现，营养素能将生物表面活性剂的产量提高15%～25%[32]。

3.3 诱变育种获得高产突变株

紫外诱变、化学试剂诱变、He-Ne激光诱变等技术是进一步提高目标菌株生物表面活性剂产量和活性的有效途径。如Lin等利用突变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对菌株BacilluslicheniformisJF-2进行诱变育种，通过筛选最后得到1株能将生物表面活性剂产量提高12倍的突变株BacilluslicheniformisKGL11[33]。转座突变既可以获得生物表面活性剂高产突变，还能鉴定到与生物表面活性剂合成相关的功能基因。侯巨梅等利用含转座子Tn917构建了假单胞杆菌BS1的突变体文库，并筛选到1株突变体，其所产生的生物表面活性剂的乳化值明显高于野生菌株[34]。

3.4 利用废弃物生产生物表面活性剂

利用廉价的废弃物代替昂贵的营养物质可有效降低生物表面活性剂的生产成本并实现废弃物的资源化利用，比如烹饪废油、乳制品、糖加工废弃物、农业废弃物、果蔬废弃物、鱼类废弃物的水解物等[35]。Mercadé等首次利用橄榄油生产废水，作为Pseudomonasaeruginosa的碳源发酵生产鼠李糖脂[36]；Fox等利用土豆加工厂的废渣作为Bacillussubtilis的碳源发酵生产生物表面活性剂[37]；Reddy等从芒果核中提取了油脂用来发酵生产鼠李糖脂[38]；Gudia等利用玉米浆作为Pseudomonasaeruginosa的培养基发酵生产生物表面活性剂[8]。利用这些废弃物既降低生物表面活性剂的生产成本又实现了废弃物的资源化利用。

4 生物表面活性剂的应用

4.1 原油开采领域

我国各油田大都已进入二次采油后期甚至三次采油阶段，但是仍有大量的石油留在岩层无法驱出，利用生物表面活性剂提高驱油效率是目前的研究热点[2，39-40]。二次采油指向油层注水补充地层压力以将石油驱出，或在三次采油阶段添加生物表面活性剂可以进一步提高石油的驱出率，外源添加生物表面活性剂产生菌，其能产生孔隙增溶、孔隙乳化现象，降低原油黏度和两相间界面张力，改善岩石的疏水性质，提高原油的流动性，从而提高采油量。

4.2 环境修复

在环境污染修复领域，生物表面活性剂主要用于土壤中重金属的去除[41]、多环芳烃[42]和农药[43-45]等有机污染物的去除、海水或土壤环境中石油污染的去除[46]、疏通人工湿地[47]等。

4.3 医药领域和日用化妆品领域

生物表面活性剂，尤其是糖脂和脂肽，具有很高的药用价值，可用于抗菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等。研究发现，鼠李糖脂、槐糖脂等生物表面活性剂能抑制某些真菌和细菌的生长[48-50]，而生物表面活性剂的抗菌机制可能与其能破坏细菌的细胞质膜有关。Duarte等研究发现，表面活性剂可有效抑制人胸腺癌细胞的生长和扩散[51]；Pradhan等研究发现，2种糖脂类生物表面活性剂对人类胚胎肾癌细胞HEK-293具有毒性作用[52]；Abdulsattar等研究发现，生物表面活性剂能有效抑制肿瘤细胞的活性[53]。此外生物表面活性剂还可以抑制或破坏多种病原菌生物被膜的形成[54-55]。生物表面活性剂凭借其良好的增溶、乳化、起泡、消泡、去污、湿润等特性可用于护理用品和家居洗涤用品，如添加到沐浴露、洗涤剂、乳液中。化妆品需要长时间与人体皮肤接触，所以对其安全性要求更高。

4.4 农业和食品领域

生物表面活性剂在农业中的应用体现在其增强动植物对细菌的防御[49]和增强植物对肥料的吸收和利用上。植物叶片表面往往覆有一层表面张力较高的蜡质，导致水溶性肥料很难湿润叶片，影响肥料的利用效率，在水溶性肥料中添加一定量的生物表面活性剂可有效解决这个问题。王亮亮等研究了2种生物表面活性剂对不同水溶肥料润湿性能的影响，结果表明，将生物表面活性剂控制在一定范围内即能对各种水溶性肥料起到良好的增湿效果[56]。Anjum等在食品工业探索了生物表面活性剂的应用，研究发现，Bacillussp. MTCC 5877所产的生物表面活性剂能有效去除蔬菜表面重金属残留，并能减少生物被膜的形成从而有效洗脱蔬菜表面黏附的有害微生物，防止生物被膜的形成[25]。

4.5 提高酶活性

已有研究表明，生物表面活性剂能促进酶解作用。Zeng等研究发现，鼠李糖脂可以将纤维素酶活性和木聚糖酶活性分别提高5.0%、5.5%[57]；Callow等研究发现，鼠李糖脂可以将TrichodermareeseiRut C30产生的纤维素酶的最高酶活性提高68%[58]。

5 展望

生物表面活性剂目前已经进入商业化生产阶段，在多个领域表现出其独特的优势[59]，但相对于化学表面活性剂，其生产成本相对较高，在以后的工作中以下几个方面将成为研究重点：(1)构建高产生物表面活性剂的基因工程菌，拓宽菌株的原料谱，减少副产物，减少其代谢旁路等；(2)开发廉价底物用来发酵生产生物表面活性剂，真正做到变废为宝，同时解决废弃物的堆积问题和发酵成本昂贵的问题；(3) 探索高效的生物表面活性剂提取和纯化工艺，降低生产成本；(4)拓宽生物表面活性剂的应用范围。比如研究生物表面活性剂在发酵过程中对微生物利用营养物质的影响，对细菌脱色不溶性染料的影响，以及对细菌产生物被膜能力的影响等；(5)挖掘新型生物表面活性剂产生菌。目前直接用于原油开采和环境工程的菌种并不多，其原因之一是这些菌株大都只具有分泌表面活性剂的能力而无其他特性(如耐热性、耐盐性、耐酸性等)，所以新型多功能生物表面活性剂产生菌的筛选仍然是未来的重点研究工作。