基于质谱的蛋白质组学技术在系统性红斑狼疮中的应用

吴碧涛，蒋文强 （绵阳市中心医院检验科，四川 绵阳 621000）

系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，其病因不明，临床表现复杂，诊断困难，治疗受限。蛋白质组学研究通过差异蛋白筛选，可发现隐藏于疾病背后的确切病理机制，找到新的、更加敏感而特异的生物标志物，提供药物治疗新靶点。本文仅就基于质谱的蛋白质组学技术在系统性红斑狼疮患者血液、尿液、唾液等体液检测中的应用作一简单综述。

1 系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见的慢性自身免疫性炎症性结缔组织疾病，起病隐匿，临床表现多样，常表现为复发加重与缓解交替进行的病程。可侵犯大多数的组织器官，包括心、脑、皮肤、关节和肾脏等［1］。值得注意的是，该病多发于育龄期女性，男女患病比例约为1∶9，且在白种人中发病率更高［2］。血清中出现高滴度的以抗核抗体为主的自身抗体为该病的又一特点，这些抗体沉积于组织，形成免疫复合物，激活免疫系统，最终导致组织器官损伤［3］。尽管对SLE的研究已较深入，但其却确的病因学及病理机制还知之甚少。普遍认为，基因、表观遗传、环境、性激素、免疫调节等因素，以及它们彼此之间的相互作用，均参与了SLE的发病［1］。目前，对SLE的明确诊断仍比较困难，患者需符合由美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）提出的11项临床及实验室诊断标准中的至少4项方能被诊断为SLE患者［4-5］。然而，这些标准只适用于对患者的分类，对于仅有早期征兆的患者可能漏诊。来自第三方实验的数据显示仅有60%的SLE患者满足ACR标准［6］。尽管将激素和免疫抑制剂用于SLE治疗后，其预后得到了很大改善，但目前尚无彻底根治办法。基于SLE病因不明，临床表现复杂，诊断困难，治疗受限，因此迫切需要发现隐藏于疾病背后的确切病理机制，找到新的、更加敏感而特异的生物标志物，发现药物治疗新靶点［7］。

2 蛋白质组学

蛋白质组学是继基因组学、转录组学之后，生命科学前沿及热点研究领域的重要代表之一［8-11］。1994年澳大利亚Macquarie大学的科学家Wilkins等首次提出蛋白质组（proteome）的概念［12］，是指一个基因组、细胞或组织表达的所有蛋白质［13］，也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其活动变化规律。而研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学被称为蛋白质组学（proteomics）。它以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究存在于细胞、组织或生物体内的所有蛋白质，包括蛋白质的组成、表达水平、结构、翻译后加工修饰、生物功能以及蛋白质之间的相互作用及其变化规律等。据此，蛋白质组学研究内容可分为：表达蛋白质组学、结构蛋白质组学、比较蛋白质组学以及功能蛋白质组学［14］。研究蛋白质组学的常用技术包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、生物信息学技术以及相对和绝对定量同位素标记技术等［15］。蛋白质分离技术主要包括双向凝胶电泳（2-DE）、双向荧光差异电泳以及液相色谱（LC）等技术。目前最普遍采用的蛋白质鉴定技术是质谱分析技术。

3 生物质谱

质谱在蛋白质组学的研究中起着至关重要的作用，是最关键的蛋白鉴定技术。质谱技术是指通过质谱分析仪鉴定经过各种途径分离的蛋白质，其基本原理是样品经离子化后，据不同离子的质荷比（m／z）来分离鉴定样品的相对分子质量［16］。质谱仪由进样器、离子源、质量分析器、离子检测器和分析系统五部分组成。其核心部分包括：离子源、质量分析器和离子检测器［17］。按质量分析器种类不同质谱仪可分为不同的类型，如：飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，TOF-MS）、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）、傅里叶变换离子回旋共振质谱（Fourier-transform mass spectrometry，FT-MS）、线性离子阱质谱（Linear ion traps in mass spectrometry，LIT）、四级杆离子阱质谱仪（quatrupole ion trap mass spectrometry）以及 Obitrap等［18］。目前常用的质谱包括基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾离子化质谱（ESI-MS）。MALDI（前者）利用激光脉冲从干燥结晶的基质中气化被分析物并使之带电，常用于分析高分子量的蛋白，测定的是肽质量指纹比对；ESI（后者）常与液相分离工具相连，将被分析物从溶液中离子化，检测灵敏度更高，可达飞克级水平，测定的是肽碎片指纹比对［16，19-21］。

4 基于质谱的蛋白质组学技术在SLE中的应用

4.1 SLE患者血液（血清及PBMC）蛋白质组学研究：血清和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）可以被容易且无侵袭性地获取。两种基质都能对来自机体不同的信号，如炎症状态，做出快速的反应［22］。尽管近年来在有关SLE的研究中，外周血单个核细胞被广泛关注［22，23-29］，血清仍是最广泛应用的血液成分。Pinna S等利用差异蛋白质组学分析提示几种蛋白质在SLE患者的PBMC中被异常表达［22］。在这些蛋白之中，PRDX2可能被用于候选生物标志物或进一步研究的靶蛋白。同时在血清中，他们发现与健康对照者相比，SLE组血清聚集蛋白水平升高了，但这个升高并无统计学意义。Φstergaard O等使用胰蛋白酶消化后，将循环微粒（circulating microparticles，MP蛋白）通过LC-MS鉴定并定量，结果发现：与对照组系统性硬化症患者和健康志愿者相比，在SLE患者血清组找到具有差异的MP蛋白超过1 000种，并发现SLE-MPs（被建议称为Luposomes）亚群对于SLE具有高度特异性［30］。在SLE-MPs中，血小板蛋白和线粒体蛋白显著减少，细胞骨架蛋白紊乱，而糖酵解酶和凋亡蛋白显著增加。在Kazemipour N及其团队［31］的研究中，实验被分为SLE组与健康对照者组，各组血清中的高丰度蛋白通过使用一种特殊的试剂盒去除后，继之用2-DE和MALDI-TOF／TOF-MS分离鉴定血清蛋白，结果在试验组找到15个差异表达的蛋白点，包括7种上调和8种下调的蛋白。这些蛋白点经进一步鉴定后被归类为3组，包括角蛋白、载脂蛋白和白蛋白以及单独的蛋白质，如转甲状腺素蛋白、触珠蛋白和凝血酶原。

4.2 SLE患者尿液蛋白质组学研究：狼疮肾炎（Lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮最常见且严重的并发症，也是导致SLE患者死亡的主要原因之一［32］。高达50%的SLE成人患者在疾病早期即有肾脏受累的征兆或者最终导致明显的肾脏疾病［33］。目前，传统的用于检测和评估狼疮肾炎的实验室标志物包括蛋白尿、尿蛋白／肌酐比值、肌酐清除率、抗双链DNA（ds-DNA）抗体、补体水平等［34］，但由于它们或者特异性不高，或者敏感性不够，其临床应用效果并不令人满意。尽管肾脏活检仍然是诊断和分类肾脏炎症和瘢痕程度的金标准［34］，由于该方法为有创性的检查，其操作具有风险性以及给患者带来不适，因此利用蛋白质组学的方法研究狼疮肾炎患者尿液被大力推广。一方面，尿液标本容易获取，可反复、连续获得；另一方面，尿液直接来源于狼疮肾炎的受累组织。因此，相较于血液标本，在狼疮肾炎患者的体液标本中，尿液显示出更广阔的应用前景。Wei R等［33］采用GC-MS的方法对比研究了狼疮肾炎、非肾炎性SLE以及健康对照者的尿液蛋白质组学，他们的试验发现与非肾炎性SLE患者组相比，狼疮肾炎组有70种胶原蛋白肽显著改变，与健康对照组比，狼疮肾炎组有230种胶原蛋白肽显著改变，这些差异蛋白被定义为“狼疮肾炎胶原蛋白肽”。Aggarwal A及其研究团队［35］根据SLE疾病活动度指数将患者分为活动性肾炎患者（AR）、活动性非肾炎患者（ANR）或非活动性组（ID），将来自各组的患者尿液蛋白通过2-DE分离，继之用MALDI-TOF-MS／MS方法鉴定。筛选出的生物标志物用ELISA的方法验证。结果发现：尿液蛋白 alpha-1 anti-chymotrypsin（ACT），haptoglobin（HAP）以及retinol binding protein（RBP）在活动性肾炎患者组被检测到，而非活动性组未检测到。Somparn P等用ESI-Q-TOF MS／MS的方法研究狼疮肾炎潜在的生物标志物，在所有升高的蛋白中，Prostaglandin H2D-isomerase（PGDS）成为了感兴趣的标志物［36］。PGDS催化PGH2的异构化产生Prostaglandin D2（PGD2），PGD2参与血小板聚集、过敏、炎性反应以及化学趋化作用。他们的研究结果显示：与非LN肾小球疾病和健康对照组相比，成年人及儿童活动性LN患者尿液PGDS表现出显著的升高。

4.3 SLE患者唾液蛋白质组学研究：研究发现，大约10%～20%的系统性红斑狼疮患者是在他们生命的前10年被首次诊断为该病［37］。该病鲜有在5岁之前发病，出现临床症状的平均年龄是12.1岁［38-40］。在临床表现、免疫学改变及治疗方法方面成年人与儿童系统性红斑狼疮并无明显不同，但比起成年人，儿童患者通常经历更高的疾病活动度以及进展性更强的疾病过程［41-42］。报道称，在儿科疾病中，自身免疫性风湿性疾病是最常见的发病和死亡原因。考虑到在儿童患者中该病较高的发病率以及死亡率，其早期诊断就显得尤为重要。传统地，患者血清中系统性红斑狼疮相关自身抗体检测扮演了非常重要的角色。然而，由于血液采样可能给患者带来不适，尤其是儿童，因此，新的侵入性更小的，甚至非侵入性的技术或方法对于儿科患者就显得尤为重要。从这个角度出发，唾液样本具有许多优势，如易获得性、快速收集、采样过程无痛苦无风险等。最新研究显示，唾液成分的变化与机体病理生理状态密切相关，被视为“人体健康状态的窗口”。唾液被认为是一个潜在的生物标志物储存库［43］。分析唾液成分变化可有效反应机体生理和病理状态。在这一背景下，系统性红斑狼疮患者唾液蛋白质组学研究显示出了诱人的前景。尽管至目前为止，该领域的研究数量有限，但相信随着研究的深入，更多的关于唾液蛋白质组学用于系统性红斑狼疮的研究成果将会被陆续报道。

5 总结与展望

近年来，蛋白质组学知识和技术的出现为研究自身免疫性疾病提供了新的视角。系统性红斑狼疮是自身免疫性疾病的重要代表。以其高通量、高敏感性及高特异性为特点，蛋白质组学技术被广泛应用于系统性红斑狼疮疾病的相关研究中，包括阐明其病理生理机制，辅助疾病早期诊断，寻找新的诊断用生物标志物以及发现可能的药物作用靶标。我们相信，这些研究将有助于进一步提高系统性红斑狼疮疾病的诊断及治疗水平。

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