骨代谢主要信号通路及信号分子的研究进展

庞新岗，李永刚*，包倪荣，丛 宇

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.南京总医院 骨科，江苏 南京 210002)

骨质疏松是一种以骨量降低和骨脆性增加为特征的骨病，每年世界范围内有超过900万例骨质疏松性骨折，并由此产生巨大的医疗花费[1]。正常情况下骨量维持有赖于骨吸收与骨形成之间平衡的维持，多种因素可打破这一平衡，目前认为年龄相关的骨代谢水平改变及绝经后雌激素水平下降、男性睾酮生成减慢是原发性骨质疏松发生的主要原因。最初抗骨吸收药阿伦唑奈等进入临床应用并取得一定疗效，但同时也面临抗骨形成、不能改善骨小梁微结构等问题，随着对骨代谢相关通路研究的深入，新的更具针对性的药物如狄诺塞麦、硬化蛋白抗体等已进入临床试验[2]。对骨代谢相关通路的研究为骨质疏松的治疗提供了更多潜在的靶点。

1 Wnt通路

Wnt通路包括经典通路 (Wnt/β-catenin)和非经典通路[Wnt-平面细胞极性(planner cell polarity pathway, PCP)通路、Wnt-钙离子通路]。在经典通路中，β-catenin是介导通路激活的关键分子。通路处于失活状态时，糖原合成酶激酶3β(GSK- 3β)、轴蛋白(axin/conductin)、腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)及酪蛋白激酶α组配形成降解复合物，通过与β-catenin N端富含丝氨酸、苏氨酸区域结合介导β-catenin的降解[3]。当Wnt蛋白与卷曲蛋白及低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)结合后，散乱蛋白(dishevelled, DSH)竞争性结合GSK- 3β，导致降解复合物解聚[4]，使β-catenin在细胞质内稳定存在，并向细胞核内转移，通过其C端与转录因子TCF/LEF结合，正性调节RUNX/Cbfα(runt related transcription factor/core-binding factor) 转录因子家族基因的表达，RUNX2能通过诱导间充质干细胞早期分化及抑制其后期凋亡促进成骨分化[5]。

Wnt非经典通路包括Wnt-平面细胞极性(planner cell polarity pathway, PCP)通路及Wnt-钙离子通路，可通过G蛋白、小G蛋白RhoA等调节钙依赖蛋白激酶、JUN N端激酶等酶的活性，最终影响过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARγ)、RUNX2以及活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFATC1)等分子的表达[6]。近来，Wnt非经典通路在骨代谢中的作用越来越被重视。如Wnt5a[7]被证实可以通过酪氨酸激酶孤受体(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor, Ror)激活JNK通路，募集C-JUN至核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB, RANK)靶基因启动子，介导破骨细胞分化。

Wnt通路受多种分子调节，包括硬化蛋白、分泌型卷曲蛋白相关蛋白(secreted frizzled-related protein, SFRP4)、阻黑蛋白(dickkopf 1, DKK1)及RSPO3(R-spondin 3)。硬化蛋白是一种天然的Wnt通路拮抗剂，可负性调节骨分化过程[8]，长期卧床及雌激素水平下降均会引起硬化蛋白表达增加。雌激素不能单独调节硬化蛋白表达，但可通过BMPs通路和Wnt/ERα(estrogen receptor)及Wnt经典通路，改变RANKL/OPG，影响硬化蛋白表达[9]。目前针对硬化蛋白的抗体已进入3期临床试验。一项多中心研究显示，硬化蛋白抗体Romosozumab显著提高绝经后骨质疏松患者腰椎骨密度(较基线增加11.3%)，并且这一效果优于阿伦唑奈和特立帕肽(较基线增加4.1%和7.1%)。而血清骨形成标志物P1NP在短期内迅速增加，并伴随骨吸收标志物水平下降[10]。此外，SFRP4 及DKK1也被证实可分别通过结合Wnt蛋白、LRP5/6聚合体抑制Wnt通路激活，而RSPO3可以拮抗DKK1的抑制作用。围绕SFRP4及 DKK1所制备的抗体尚有待进一步临床验证[11]。

2 BMP通路

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)属于转化生长因子β(transforming growth factor, TGF-β)超家族，可通过经典的BMP/Smad通路和非经典MAPK通路调节骨代谢[12]。根据氨基酸和核苷酸相似性BMPs被分为4个亚族：BMP2/4、BMP9/10、BMP5/6/7/8、BMP12/13/14。已证实BMP2与BMP7在促进骨愈合方面具有良好的安全性和有效性，并进入临床使用，而BMP3和BMP13被证实是骨生长的负性调节分子。

BMPs受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体，分为1型受体(BMPRIA、BMPRIB和ACVRI)和2型受体(BMPRII、ActrIIA和ActRIIB)，在经典途径中，BMP配体与2型受体结合，磷酸化1型受体激活下游R-Smads(Smad1,5,8)[13]，R-Smads与Co-Smads形成复合物转位至细胞核内，启动RUNX2及Osterix等靶基因转录，促进成骨分化。在非经典途径中，BMP通过BMPR1A可以募集TAB1-TAK1复合物，短时间内激活TAK1/2-MEK1/2-ERK1/2信号通路，调节P16INK4a等靶基因表达，影响成骨分化过程。这一途径受酪氨酸激酶c-Abl调节。C-Abl通过磷酸化BMPR1A羧基端特定的酪氨酸残基，促使BMPR1A与BMPR2相互作用，激活BMP-Smad通路[14]。BMP通路的促成骨分化作用还与组蛋白去甲基化有关。BMP4/7可通过Smad上调间充质干细胞中去甲基酶KDM4B和KDM6B，这两种去甲基酶通过移除H3K9m3和H3K27m3，募集RNA聚合酶启动DLX与HOX的表达，进而启动成骨分化相关的RUNX2与SP7(OSX)的转录，同时增加BMP2和BMP4的表达，形成正反馈调节。

3 RANKL通路

NF-κB是参与免疫和细胞应答的重要转录因子。在哺乳动物中，NF-κB家族包括RelA (p65)、 RelB和 c-Rel、以及前体蛋白NF-κB1(p105)和NF-κB2(p100)，后两种可被加工成p50 和p52。经典途径中，IKKβ和NEMO(NF-κB essential modulator)引起IκBα磷酸化和P65/P50异源二聚体向核内转位。非经典途径中，NIK(NF-κB-inducing kinase)与IKKα磷酸化P100，并将其加工为P52，释放RelB/P52复合物。

RANKL作为肿瘤坏死因子可以通过肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor-associated factors, TRAFs)及NIK分别参与NF-κB经典和非经典途径的调控[15]。这一过程受多种分子调控。已证实，TRAF2,5,6在NF-κB途径中起正性调节作用，而TRAF3则通过抑制NIK-IKKα通路及上调NF-κB途径负性调节分子1型IFN的表达，对破骨分化产生抑制效应[16]。信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)广泛参与破骨细胞分化过程，RANKL可引起白介素表达增加，导致STAT1,5,6激活并上调Dusp1和2的表达，使MAPK通路去磷酸化，最终对破骨分化产生负反馈调节[17]。破骨细胞中存在的Zfp521(zinc finger protein 521)可抑制Ebf1(early B cell factor 1)靶基因Ccl9的表达，从而阻断Ccl9对RANKl通路的增强效应[18]。

与Wnt通路相似，RANKL-RANK通路也存在天然拮抗剂OPG。OPG是肿瘤坏死因子受体超家族成员，通过竞争性与RANKL结合抑制RANKL通路，从而抑制体内破骨细胞的分化、活化，并促进其发生凋亡。既往认为OPG由成骨细胞和骨细胞分泌调控骨转化，但最近研究证实淋巴细胞是骨髓中主要的OPG来源。此外，破骨细胞还存在RANKL的第2受体[19]，即富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 4, LGR4)，可以与RANK竞争性结合RANKL后激活GSK- 3β和Gαq-钙离子途径，抑制T细胞活化核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1, NFATC1)的表达。

4 NOTCH通路

NOTCH是调节细胞生命进程的进化保守的信号受体，包括NOTCH1- 4 4种亚型，分为胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域NICD，配体为JAG1、JAG2和Delta样1，3和4，表达受Wnt等信号通路调控。重组信号结合蛋白jκ(recombination signal-binding protein jκ，RBPjκ)是NOTCH通路下游重要的转录因子。NOTCH未激活状态下，RBPjκ与转录抑制因子结合，阻止靶基因转录。NOTCH与配体结合后，受γ-分泌酶水解作用释放NOTCH胞内段(notch intracelluar domain, NICD)，NICD向核内转移，与RBPjκ结合，使其与转录抑制因子解离，启动靶基因HES1和HEY1 等的表达[20]。

在成骨细胞中，NOTCH可以抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，促进成骨细胞成熟，这一作用与HES蛋白对成骨细胞的吻合。既往研究显示，HES1转基因小鼠表现为成骨不全，但在成熟成骨细胞中条件敲除HES1可增加骨矿化。

系统性慢性炎性反应可引起骨量丢失，比如类风湿性关节炎患者常伴有明显骨质疏松，这一现象与炎性因子对骨代谢的调节有关[21]。已证实炎性反应因子如IL1,6、TNFα可以诱导破骨细胞分化，除此以外，TNFα等还可以通过NOTCH影响成骨细胞分化。研究发现[22]，P52/RELB可以与NICD结合，增强RBPjκ对靶基因转录的启动作用，而TNFα可以上调NF-κB的表达。通过γ-分泌酶抑制剂阻断NOTCH通路可以增加动物模型的骨密度，这可能为治疗骨质疏松提供新靶点。

5 通路间相互交联构成网络

细胞信号通路相互关联构成复杂网络结构，精确调控分化过程。在成骨细胞中，Wnt经典通路的靶基因之一JAG1编码的蛋白是NOTCH信号通路的重要配体，因而成为NOTCH与Wnt通路关联的重要节点。而Wnt通路也受到其他信号通路的调节。Wnt通路活化过程中需要钙通道的开放和PKC/ERK的参与，钙通道蛋白需要在特定半胱氨酸位点发生巯基化才能发挥生物学作用[23]，内源性硫化氢是巯基化必需的物质，雌激素通过上调胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ裂解酶(CSE)水平增加细胞内硫化氢水平，从而实现对Wnt通路的调控。GATA家族是一类与DNA(A/T)GATA(A/G)序列结合的转录因子，GATA4是雌激素调节TGF-β/BMP/Smads的关键因子，其表达受雌激素信号通路调节，并协助雌激素受体与DNA结合，启动或抑制靶分子如BMP4、BMP6、TGF2/3、BMP受体的转录[24]。

6 问题与展望

长久以来，骨质疏松症由于其较高的发病率和病死率已成为严重的公共卫生问题，据统计，在50岁以上的人群中，有1/3的女性和1/5的男性存在骨质疏松，而其中有20%左右的老年患者会因股骨颈骨折死亡。目前临床广泛应用的双磷酸盐类药物虽然有效抑制骨吸收，但同时也面临抗骨形成和不能改善骨小梁微结构等问题。随着骨代谢相关通路研究的深入，抗骨质疏松药物的研发也越来越具有针对性，从最初阿伦唑奈及特立帕肽的经验性用药到2010年第1次针对RANKL通路研发狄诺塞麦，以及目前投入临床试验的硬化蛋白抗体，使抗骨质疏松药涵盖抗骨吸收和促骨形成多个方面，这为逆转骨质疏松病骨量提供可能。此外，随着炎性反应、雌激素水平，氧化应激等在骨质疏松发病机制研究中的深入，使得部分具有药理活性的天然化合物,如氯喹和金雀黄素等被用于抗骨质疏松药物的研究。传统中药补肾益气方在传统医学中被用于骨质疏松的治疗，其单体成分的研究也为药物开发提供借鉴意义。