环状RNA与心血管疾病

李少川，李菊香

(南昌大学第二附属医院 心血管内科， 江西 南昌 330006)

1 环形RNA(circular RNA,circRNA)概述

CircRNA首次在RNA病毒中被发现[1]，随后在酵母菌和真核生物中也证实其存在，小鼠的性别决定区SRY中也发现了circRNA。随着测序技术的发展，尤其是RNA-seq技术的开发[2]，circRNA的研究在几年得到快速发展。circRNA的主要特征是环状结构，外显子的3′端转回并连接其上游外显子的5′端以形成闭合分子。与经典的线性RNA不同，circRNA不存在5′帽和3′多聚腺苷酸尾。由于不存在游离末端，所以这些分子不容易水解，特殊的环形结构使circRNA具有一定的保守性和稳定性[3]。对脱支酶和RNA外切核酸酶具有较高的抵抗，也因为一些外显子环RNA的基因产物水平高于线性RNA， 所以circRNA可以作为生物标志物来诊断疾病，也可以作为预后评估的一个指标，还可以在治疗的关键靶点等方面具有明显的优势。由于circRNA分子富含miRNA结合位点，可以特异性地结合miRNA并抑制其功能，这一机制称为竞争内源RNA(ceRNA)机制，类似海绵吸收miRNA，称之为miRNA海绵体作用(miRNA sponge)。许多疾病与circRNA相关，如肿瘤、神经系统、心血管和自身免疫性等疾病都被证明与circRNA密切相关。circRNA通过与疾病关联的miRNA作用在分子水平对疾病进行调节，提示circRNA可以成为一种新的基因表达调节剂。

1.1 circRNA与心肌肥厚

目前有多种机制解释心肌肥大如何进展成心力衰竭，如通过钙调神经磷酸/NFAT途径和血管紧张素系统等发挥作用，但尚无一个公认的机制诠释心力衰竭的发生和发展。有报道指出从circRNA数据库中随机筛选了100个circRNA，其中 36个circRNA在心脏高度表达，称为心脏相关的circRNA(HRCR)。并发现HRCR可以通过与miRNA结合发挥其生物学功能[4]。miR- 223通过抑制其下游靶点ARC(具有CARD结构域的凋亡阻抑物，ARC的3′UTR是miR- 223的结合位点)，使其表达降低。miR- 223使ARC在心肌细胞中表达降低，可以增强异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌肥厚作用。HRCR可以作为miR- 223海绵状物结合并抑制miR- 223的活性，因此认为 HRCR是抗增殖因子，抑制心肌的肥大，初步的结果证明circRNA在心肌肥大诱发的心力衰竭中起关键作用。虽然证明miR223可以由 HRCR调节，但是不排除其他circRNA或其他基因及表达产物可直接或间接地调节miR- 223。在ISO心力衰竭模型中的其他HRCR非依赖性途径和它们在调节miR- 223中的作用尚需进一步确定， miR- 223的下游靶点需更深入的研究。

1.2 circRNA与心肌细胞衰老

心肌细胞衰老是身体功能的逐渐恶化和死亡的主要原因，可发生在细胞水平或生物水平。细胞衰老，也称为复制衰老，其特征在于二倍体细胞的有丝分裂停止，而生物水平衰老的特征在于应激反应降低和稳态平衡被打破，导致生物体的正常功能丧失。在生物应激中，常用化学药物多柔比星(Dox)来产生氧化应激以诱导细胞凋亡，制作心肌功能不全模型[5]。circRNA Foxo3的异位表达促进Dox诱导心肌病形成，但沉默内源性circRNA Foxo3可以减缓Dox的作用并阻止心肌病的形成。细胞质中异位表达的circRNA Foxo3结合抗衰老相关蛋白ID1和E2F1、抗应激相关蛋白HIF1α和FAK(HIF1α和FAK均可以抑制衰老)。细胞质中Foxo3的增加导致细胞质中ID1、E2F1、HIF1α和FAK的含量减少。这些蛋白质的抗衰老功能被阻断，其结果是，circRNA Foxo3的异位表达促进细胞衰老，而沉默circRNA-Foxo3减少细胞衰老和凋亡。有报道灵芝可以抑制CIRC-Foxo3并且提高左室射血分数,改善心输出量，改善心肌衰老[6]。

1.3 circRNA与心肌细胞纤维化

心肌纤维化受多种因素调节，其中基因水平的影响不容忽视。有报道在小鼠心肌纤维化模型中circRNA的表达谱和潜在机制[7]。使用circRNA微阵列检查糖尿病小鼠心肌的circRNA发现43个circRNA异常表达，包括24个上调和19个下调。在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)处理的糖尿病小鼠心肌中的心脏成纤维细胞(CFs)中，circRNA_010567显著上调。生物信息学分析预测circRNA_010567可以作为miR- 141的海绵体，而且miR- 141可以直接靶向TGF-β1并抑制其表达(双荧光素酶测定验证)。随后实验显示circRNA_010567沉默可上调miR- 141并下调TGF-β1(纤维化的必需分子)表达。同时可以抑制Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA等成纤维细胞的表达。circRNA_010567 / miR- 141 / TGF-β1在糖尿病小鼠心肌纤维化模型中起着重要的调节作用。同时有类似研究发现circRNA_000203可以通过消除miR- 26b- 5p与Col1a2和CTGF的靶标相互作用来抑制miR- 26b的抗纤维作用[8]。这个过程也是利用了circRNA的miRNA的海绵作用与miR- 26b- 5p紧密结合。circRNA_000203特异性增强Col1a2、Col3a1和α-SMA等成纤维细胞的表达，miR- 26b就是通过抑制Col1a2、Col3a1、α-SMA和CTGF在内的纤维化相关基因的表达而起到抗纤维化的作用。所以circRNA_000203的表达增多会引起心肌纤维化。circRNA_010567和circRNA_000203分别作为miR- 141和miR- 26b- 5p的海绵体起到抑制miRNA的作用。上述研究发现心肌纤维化的过程中两类RNA相互作用至关重要。miRNA可以抑制纤维化，而circRNA可以抵消miRNA的抗纤维化作用，从基因水平阐述了心肌纤维化的调控作用。

1.4 circANRIL动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种全身性疾病，是由于脂肪沉积物、炎性反应、细胞和瘢痕组织在动脉壁内积累而导致的疾病。 有报道circ ANRIL参与AS发生[9]，circANRIL是在染色体9p21的AS基因座上转录的INK4基因座。circANRIL中的环状反义非编码RNA通过控制核糖体RNA(rRNA)成熟来调节动脉粥样硬化形成。实验证实circANRIL结合到rRNA的C端赖氨酸丰富的区域PES1上，占据PES1与pre-rRNA结合位点，阻止核酸外切酶介导的rRNA成熟。circANRIL抑制核糖体形成过程并导致pre-rRNA的积累，导致p53活化和随后细胞凋亡增加，导致增殖率的降低，通过减少过度增殖的平滑肌细胞使动脉粥样硬化发生减少。提示circANRIL可以作为治疗AS的潜在治疗靶标。

1.5 circRNA与冠心病

冠心病(coronary atherosclerotic heart disease， CAD)是心血管疾病中致死率最高的疾病[10]，一直被临床工作者重视，但早期诊断存在一定的困难。目前诊断的方式有很多种，无创检查有心电图(ECG)、心电图平板运动实验(TET)、动态心电图(Holter)监测和冠状动脉计算机断层摄影(CTA)，有创冠状动脉造影(CAG)检查。但是各自存在弊端，ECG灵敏度以及特异性低，CTA价格昂贵，患者一般难以接受CAG检查。hsa_circ_0124644在冠状动脉疾病的患者中明显上调，灵敏度和特异性分别为0.861和0.626，hsa_circ_0098964敏感性和特异性分别为0.825和0.730[11]。常规ECG的灵敏度和特异性已显示为0.290和0.670[12]。Holter及TET监测的灵敏度和特异性分别为0.649、0.894[13]和0.731、0.693[14]，CTA的灵敏度和特异性分别为0.920和0.750[15]，CAG一直作为CAD的诊断金标准。综合价格和患者的依从性等因素，hsa_circ_0124644和hsa_circ_0098964可以作为诊断CAD的一种手段。而且circ RNA的特殊环状结构不易被酶分解，更加证明了其可以作为诊断CAD的一种方法。

1.6 circRNA与心肌梗死

心肌梗死(myocardial infarction,MI)一般发生于冠心病的基础上，心肌梗死多伴有心肌细胞的凋亡。有报道用左前动脉永久结扎制造大鼠心力衰竭模型发现circRNA Cdr1as和miR- 7a的共表达，且Cdr1as是miR- 7a的海绵体，可以抑制miR- 7a的生物学功能[16]。miR- 7a通过靶向抑制PARP和SP1的表达(PARP和SP1均是可以促进心肌凋亡的蛋白)，从而抑制MI的心肌凋亡。circRNA Cdr1as可以引发MI，其中一条途径就是通过抑制miR- 7a对PARP和SP1的抑制作用。还发现miR- 7a并不受过表达的Cdr1as所诱导， miR- 7a对正常的心肌细胞凋亡无影响，仅仅对应激诱导的心肌凋亡有影响，并且在应激状态下才会被Cdr1as所抑制。有报道在冠脉结扎诱导的心肌细胞凋亡大鼠模型中发现mm9-circ 01659 明显上调，称之为MFACR(线粒体裂变和凋亡相关的circRNA)，通过海绵体作用下调miR- 652- 3p控制心脏线粒体分裂和细胞凋亡[17]。miR- 652- 3p可以通过抑制MTP18(线粒体蛋白18)的表达来阻断线粒体裂隙和心肌细胞死亡。MFACR在细胞质中直接螯合miR- 652- 3p并抑制其活性。 实验证明敲低MFACR的小鼠心肌细胞线粒体裂解的现象减弱,表明circRNA在调节心脏线粒体动力学和凋亡中的关键作用。MFACR和circRNA Cdr1as的发现为进一步研究MI的发生以及后续的诊断和治疗提供了新的依据。

1.7 circRNA与主动脉瘤

主动脉瘤是指主动脉病理性的扩张，超过正常血管直径的50%，具有很高的死亡风险，发生机制复杂。有报道发现hsa-circ- 000595与主动脉平滑肌凋亡有关，进而影响主动脉瘤的发生。在低氧条件下主动脉平滑肌细胞中hsa-circ- 000595的表达上调，通过敲低hsa-circ- 000595发现低氧条件下主动脉平滑肌细胞凋亡减弱。实验还发现hsa-circ- 000595是作为miR- 19a海绵体来起作用的，hsa-circ- 000595减低可以使miR- 19a表达增加，从而减少平滑肌细胞凋亡[18]。miR- 19a影响平滑肌细胞的机制还需要进一步探讨，但是hsa-circ- 000595的发现可以为诊治主动脉瘤提供一个新的基因学上的依据。

2 小结

随着基因测序技术的升级，越来越多的基因组数据库被建立，有许多在线数据库可以用于circRNA的研究，目前仅有少数circRNA被证明与心血管疾病有关，如HRCR、hsa_circ_0124644和circRNA Cdr1as等，其中大部分circRNA都是作为miRNA的海绵体而发挥作用，提示两者之间可能存在着某种联系，但作为与遗传高度相关的高血压和心律失常等疾病却无circRNA的身影，现已发现人类体内含有上万个circRNA，其中是否有大量和心脏疾病相关的circRNA值得研究。