细胞焦亡与组织纤维化

张 力，茆 军，张 立，黄正泉，梅 伟，丁 亮，王培民

(1.南京中医药大学， 江苏 南京 210023 ；2.南京中医药大学附属医院 骨伤科，江苏 南京 210029)

细胞焦亡(pyroptosis)是一种依赖半胱氨酸天冬氨酸(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族蛋白酶活性的细胞程序性死亡形式。最初对焦亡的研究聚焦于机体的免疫防御，这种特殊的细胞死亡方式能有效破坏病原菌的生存环境并控制感染；近年来的研究则更多的关注到焦亡在清除内源性危险信号传导过程中扮演的角色。此外，细胞焦亡及其释放的炎性因子与肺、肝、肾等组织的纤维化密切相关，参与形成“焦亡-炎性反应-纤维化”轴样病理改变。本课题组关注细胞焦亡在膝骨关节炎中的作用，率先揭示了膝骨关节炎的滑膜成纤维细胞存在NLRP1、NLRP3炎性小体的激活，并诱导细胞焦亡，促进下游炎性反应，对膝骨关节炎的病程进展存在推动作用[1]。然而，焦亡在膝骨关节炎中的具体激活机制及其与滑膜纤维化的联系仍在紧张的探索中。

1 细胞焦亡的特征与激活

1.1 细胞焦亡的特征

细胞焦亡主要发生在巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等骨髓系吞噬细胞，此外，在CD4+T细胞、角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞和神经细胞中也发现了焦亡的证据。焦亡的发生，首先会在细胞膜上形成1.1～2.4 nm的孔洞，进而导致跨膜离子通量异常和细胞肿胀，最终，细胞膜破裂并伴随着促炎因子IL-1β、IL-18的释放而发生渗透溶解。这一形态变化与细胞坏死具有相似之处，同时焦亡也表现出细胞核浓缩和染色质DNA 断裂等细胞凋亡的生化特点。

细胞焦亡区别于其他细胞死亡方式的重要特征主要包括3个方面：1)焦亡依赖于caspase-1 或caspase-4/5/11，它们分别通过经典途径和非经典途径启动焦亡过程。2)细胞膜形成孔洞。3)促炎因子IL-1β、IL-18的释放及其诱发的炎性级联放大反应。

1.2 炎性小体的激活

炎性小体被定义为一种细胞内多聚蛋白复合物，由模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)、适配器蛋(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和效应酶(caspase)组装而成，通过分泌细胞因子、介导细胞死亡等细胞反应抵御即时危险。

经典途径的细胞焦亡以NLPR3炎性小体的研究最为彻底。当细胞上的PRRs受到信号刺激时，NF-κB信号通路将介导NLRP3蛋白和IL-1β、IL-18前体的上调。随后，积聚的NLRP3蛋白，ASC和caspase-1前体形成具有活性的NLRP3炎性小体，水解 pro-caspase-1为活性形式caspase-1。激活的caspase-1进一步发挥其切割IL-1β、IL-18和活化gasdermin-D(GSDMD)的作用，驱动IL-1β和IL-18的成熟分泌及焦亡。

在非经典途径的细胞焦亡中，革兰阴性菌的LPS直接或通过TLR 4激活caspase-11(人caspase-4和caspase-5)，随后剪切GSDMD来介导焦亡，该途径中，IL-1β、IL-18前体的成熟分泌仍然依赖经典途径中caspase家族和相应炎性小体的激活。

除此之外，当caspase-1或GSDMD被抑制时，caspase-8能够与NLRC4相互作用，随后被招募到Naip5/NLRC/ASC炎性小体中，该过程依赖ASC，但独立于caspase-1和caspase-11，活化的caspase-8进一步介导IL-1β、IL-18的成熟并诱导细胞焦亡[2]。

1.3 Gasdermin D的介导

GSDMD是gasdermin蛋白家族的一员，是人类和鼠科动物细胞焦亡的重要介质。CRISPR-Cas9 技术证实，GSDMD对经典和非经典途径的细胞焦亡而言，都是必须的。活化的 caspase-1/4/5/11可对GSDMD进行特异性切割，这种切割是驱动焦亡的充分必要条件。此外，GSDMD控制IL-1β的释放，但不控制成熟[3]。

被切割后的GSDMD将其N-末端结构域插入细胞膜，并组装大量的寡聚复合体组装跨膜孔来靶向、插入和渗透细胞膜[4]。因此，GSDMD是一种新型的造孔蛋白并与细胞焦亡时细胞膜表明的空隙形成有关，然而，其中涉及的具体机制尚不明确。

2 细胞焦亡与组织纤维化

纤维化是组织慢性纤维增生性的过程，以效应细胞-成纤维细胞的增殖和细胞外基质蛋白(包括胶原纤维)的沉积为主要特征，最终导致组织瘢痕形成。常见纤维化组织包括肝、肺、肾和滑膜，其共同特点是慢性炎性反应的浸润，免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞和其他常驻细胞释放炎性介质。近来，对细胞焦亡的研究中发现了“焦亡-炎性反应-纤维化”这样的轴样病理改变，参与了多种组织的纤维化过程，推动病程进展。

2.1 肝纤维化

细胞死亡和炎性反应是肝纤维化发展的两大核心因素。炎性小体存在于肝细胞和非实质肝细胞内，是调控炎性反应和细胞命运的关键。它们通过激活caspase-1，诱导细胞焦亡，并释放促炎因子IL-1β和IL-18启动炎性级联放大，这一过程可以推动纤维化的进展，其主要的细胞靶点是肝星状细胞的激活。在慢性炎性肝病中，巨噬细胞和中性粒细胞往往作为活化肝星状细胞的上游而受到广泛的研究。

在NLRP3基因过表达的小鼠中，NLRP3炎性小体的持续激活会导致小鼠存活时间缩短，生长不良，中性粒细胞浸润和肝脏星状细胞活化，肝脏炎性反应严重，肝内胶原沉积，肝脏纤维化明显，同时，流式细胞术分析非实质中分离出肝细胞活性caspase-1-碘化丙酸丙酯(PI)阳性细胞[5]，证实了肝细胞焦亡的存在，进而将“肝细胞焦亡-肝脏炎性反应-肝纤维化”联系了起来。体外实验中，细胞外ATP可以通过P2X7受体激活肝星状细胞NLRP3炎性小体，并促进α-SMA 和Ⅰ型胶原等纤维化标志物的释放而导致肝纤维化[6]，然而，肝星状细胞是否进一步发生焦亡却未在研究之列。抑制caspase-1和IL-1β的小鼠则表现出肝脏纤维化程度的减轻。众所周知，IL-1β是肝纤维化过程的重要媒介，可促进肝脏星状细胞的增殖和分化，上调成纤维标志物水平，包括金属蛋白酶、组织金属蛋白酶抑制剂-1、胶原-1α1和转化生长因子-β等。

越来越多的证据支持轴样病理改变在肝纤维化发展中的中心作用。在肝kupffer细胞、肝星状细胞的实验性纤维化模型中，发现了包括NLRP1、NLRP3和AIM 2炎性小体的显著高表达[7-8]；在非酒精性脂肪肝炎的小鼠模型中，纤维化改变依赖NLRP3的激活，这表明靶向这种复合物可能是阻止或逆转非酒精性脂肪肝炎中肝脏纤维化发展的有效手段[9]。骨髓间充质干细胞包含microRNA-233的外泌体能缓解LPS/ATP所致肝细胞损伤，下调NLRP3、caspase-1及多种纤维化相关细胞因子的表达[10]。这些发现，为“焦亡-炎性反应-纤维化”的干预治疗提供了新的思路。

2.2 肺纤维化

肺纤维化涉及炎性反应和间质纤维化，导致间质组织和基底膜细胞外基质的聚集，肺泡结构的破坏。肺上皮细胞通常被认为是肺纤维化的主要效应细胞。

NLRP3-/-的肺泡上皮细胞中，炎性反应减弱，纤维化标志物的水平也相应降低[11]。同样，在基因缺乏ASC或caspase-1或用caspase-1抑制剂处理的纤维化模型小鼠中，肺中性粒细胞的浸润出现减弱[12]。在高氧状态下，NLRP3-/-小鼠表现出较低的肺部炎性反应，包括炎性细胞浸润和细胞因子表达[13]。这些发现为肺纤维化中的细胞焦亡与炎性反应构建联系。

博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，NLRP3、caspase-1、ASC均存在高表达，下游IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α相应上调，促炎因子进一步通过TGF-β1-磷酸化SMAD和ERK1/2上调胶原Ⅰ/Ⅲ、纤连蛋白及α-SMA参与肺纤维化[14]。在LPS诱导小鼠急性肺损伤模型中，肺组织NLRP3和ASC出现高表达，下游IL-1β、IL-18和TGF-β1的升高则介导了肺纤维化改变。在巨噬细胞株上进行的离体实验发现，LPS/ATP能诱导的细胞活性氧ROS的生成，活化caspase-1，随后引起与上述动物模型相似的纤维化反应[15]。这些研究虽然对NLRP3炎性小体及下游促炎因子的表达水平做出了定量分析，但缺少对细胞焦亡的直接观察。尽管如此，炎性小体的激活与炎性反应、纤维化密切相关，这一点仍然可以作为研究“焦亡-炎性反应-纤维化”轴在肺系病变的依据。

2.3 肾纤维化

在慢性肾病中经典和非经典途径都可以激活NLRP3炎性小体，并参与随后的多种病理变化，例如肾小球肾炎或是肾小管间质的损伤。

肾小管上皮细胞内，NLRP3会通过非经典途径激活并介导间质纤维化，奇怪的是，该研究并未发现IL-1β的差异。另有研究关注NLRP3对肾小管上皮细胞TGF-β信号的调节作用，TGF-β刺激不仅以Smad 3依赖的方式增加NLRP3的表达，同时，TGF-β介导的Smad 2和Smad 3磷酸化需要NLRP3和ASC的参与[16]。如此看来，NLRP3炎性小体激活后对肾纤维化的直接影响似乎越过了炎性反应的介导。

在自噬缺陷导致肾纤维化的过程中，若肾细胞中的自噬激活剂受到抑制，将会激活细胞焦亡并导致纤维连接蛋白自噬清除功能的损害，而纤维连接蛋白作为细胞外基质的过度沉积，将进一步导致肾纤维化[17]。

尽管缺乏对于“肾细胞焦亡-肾炎性反应-肾纤维化”的相关报道，然而，焦亡分别对于肾炎性反应和肾纤维化的独立病理环节存在推动作用，其中涉及的具体病理机制，有待进一步的探索。

2.4 滑膜纤维化

关于滑膜组织细胞焦亡的研究来源于自身免疫性疾病的研究，例如，痛风、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮。风湿性疾病的致病因素如尿酸单钠、碱性磷酸钙、草酸盐等微晶，可以导致NLRP3炎性小体的激活，启动巨噬细胞焦亡及IL-1β的释放。RA患者的外周血液中即有NLRP3炎性小体的产生，活动型RA患者则具备更高的NLRP3、ASC、活性caspase-1和pro IL-1β水平[18]。目前，RA的滑膜组织中是否存在细胞焦亡尚为验证，但在RA模型小鼠中，抑制 NLRP3炎性小体的激活可以减轻滑膜炎性反应与滑膜纤维化[19]，本团队率先揭示了膝骨关节炎中成纤维样滑膜细胞的焦亡介导滑膜炎性反应，据此推测，RA滑膜组织也可能存在焦亡。

3 问题与展望

综上所述，细胞焦亡及其在“焦亡-炎性反应-纤维化”中的核心作用得到了广泛的研究。然而，由于缺乏直接的观察手段，目前的研究对细胞焦亡的鉴定尚无统一的定论。通过对炎性小体复合物，GSDMD等焦亡关键物质及下游促炎因子的定量分析，结合细胞死亡的观察、DNA断裂的判定是否能充分肯定细胞焦亡的发生仍待进一步探索。可以肯定的是，其介导的炎性级联反应加剧了组织纤维化的病程进展，虽然具体病理机制有待继续阐明，但针对焦亡寻找治疗的新方法意义重大。