甲状腺癌相关基因及其在临床诊断中应用的研究进展

魏 佳，王瑶琪，孙 旭，逄仁柱，杨 帅，石 亮，李 勇，孟宪瑛

(吉林大学第一医院甲状腺外科，吉林 长春 130021)

甲状腺癌是最常见的来源于内分泌系统的恶性肿瘤之一，近30年来其发病率在世界范围内逐年上升[1]。在各类甲状腺癌中，甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的分型，其次是甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)，来源于甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)的甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)较为少见，恶性程度高、预后差的未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)最为少见。现阶段针对甲状腺癌的诊断主要依靠颈部超声及超声引导下细针穿刺活检(fine-needle aspiration biopsy，FNAB)[2]。随着甲状腺癌基因水平研究的日渐增多，已经发现了多种与甲状腺癌发生发展相关的基因，其为甲状腺癌的早期诊断提供了一些新思路。学者们在从事甲状腺癌相关基因的研究过程中不仅发现不同的基因突变或重排可能导致不同分型的甲状腺恶性肿瘤，还发现了相关基因的改变会影响肿瘤的侵袭性和预后等。研究者们对一些基因发生突变的原因也有了一些认识，但是甲状腺癌病因学方面的研究尚不明确。目前国内外针对甲状腺癌相关基因的多项研究中已经初步建立了甲状腺癌在基因层面的早期诊断方法，明显提高了甲状腺恶性肿瘤的超早期诊断水平，并且能够运用基因的相应特点指导临床治疗[3]。

1 甲状腺癌相关基因

1.1 v-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1(BRAF)基因突变BRAF基因定位在7号染色体上，编码BRAF激酶，在包括甲状腺癌在内的多种恶性肿瘤中均发现有BRAF基因突变。BRAF在RAS/RAF/丝苏氨酸蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路中起到连接RAS和MEK的作用，RAS能够结合并激活BRAF激酶，然后由BRAF磷酸化并激活MEK，进而激活ERK和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的所有下游效应器分子，最终影响细胞的生长和增殖。这一连锁反应与甲状腺肿瘤的发生、侵袭、转移和复发有密切关联[4]。BRAF基因突变在甲状腺良性肿瘤和PTC中比较常见。绝大多数(61.7%)BRAF突变为BRAF V600E位点发生碱基取代，BRAF V600E突变是PTC发展过程中的启动基因，突变发生在BRAF基因第1 799位点上，表现为碱基T突变为A，该位点也有其他突变发生，包括碱基T突变为G或C，但是T到A的突变与PTC的发生最为密切[5]。该突变导致了氨基酸链的第600位密码子处的缬氨酸被替换为谷氨酸，从而激活BRAF激酶使其出现致癌作用[6]。在PTC中，最常见的基因改变就是BRAF突变(36%～69%)，且在不同的地域和人种中均有分布[7-8]。有研究[9]表明：在PTC中47.8%的BRAF基因发生突变，BRAF V600E基因与肿瘤的中央区淋巴结转移和侵袭性有密切关联，并且只有中央区淋巴结转移与BRAF V600E突变有关，所以对BRAF V600E进行基因检测有助于临床医生判断术中是否需要预防性清扫颈部淋巴结。

1.2 转染中重排(rearranged during transfection,RET)/PTC基因重排和RET基因突变RET基因位于人10号染色体的长臂11.2区，其编码的膜受体酪氨酸激酶蛋白可以调节细胞的增殖、生长、分化、迁移和凋亡，该受体蛋白高度表达于滤泡旁细胞中。RET基因重排后与PTC的发生关系密切，故重排后称为RET/PTC基因。RET/PTC重排后导致甲状腺滤泡细胞中的受体酪氨酸激酶被激活而引起MAPK通路异常激活，使通路下游信号持续开放，导致细胞癌变[10]。最常见的RET重排是RET/PTC1和RET/PTC3，占全部突变的90%以上，并且RET/PTC1和RET/PTC3重排均来源于10号染色体的倒位[11]。RET/PTC重排在PTC中发生的频率仅次于BRAF突变。RET基因重排与电离辐射、地区、年龄和性别等有关联，在中国大陆人群中比较少见，RET/PTC3常见于儿童PTC且与电离辐射史有密切关联[12]。

RET基因突变与MTC关系最为密切， MTC是来源于甲状腺滤泡旁细胞的肿瘤。RET基因的多个外显子均可发生突变，其中16号外显子突变所占的比例最高[13]。另外，Romei等[14]在研究中发现： RET基因在某些位点上的突变导致的MTC有遗传因素的影响，在729例曾被分类为散发性MTC的病例中47例有家族遗传史(6.5%)，由此可以预测约有20%～25%的MTC患者为家族遗传性甲状腺髓样癌(familial medullary thyroid carcinoma，FMTC)。

1.3 RAS基因RAS致癌基因家族有3种不同的家族成员，分别是K-ras、H-ras和N-ras，分别定位在12、11和1号染色体上，在甲状腺癌发生发展过程中调节2个重要的独立通路，即MAPK通路和PI3K/Akt通路。这3种基因在甲状腺癌中均有发生突变的现象，其中N-ras基因第61密码子突变最常见，其次为第12位密码子，然后是H-ras基因的突变[10]。RAS突变与BRAF突变表现出与组织学的紧密联系，并且证实了MAPK通路的改变在甲状腺癌的发生中起到重要的作用[15]。学者们在RAS基因第12和61位密码子突变中发现了体细胞单核苷酸突变，并且发现RAS基因突变不仅发生于恶性肿瘤当中，也可能出现在增生的甲状腺结节中，其突变概率在滤泡状腺瘤中为20%～40%，PTC中约10%，FTC中为30% ～50%，ATC中约55%，而滤泡乳头状癌中为25% ～45%[16]。

1.4 端粒酶逆转录酶(telomerase reserve transcriptase,TERT)基因TERT启动子突变可改变端粒酶活性，端粒酶是存在于染色体末端的核蛋白复合物，涉及端粒的延伸，其DNA序列由几个重复的碱基TTAGGG组成，其主要功能是保护染色体完整性和基因组稳定性，因此，该突变在细胞的增殖和肿瘤的生成过程中起到十分重要的作用[9]。端粒复合物由不同的部分组成，其中最重要的是端粒酶逆转录酶催化亚单位、端粒酶的RNA组分和角化不良蛋白[17]。TERT启动子突变在FTC和PTC中均有检出，突变发生在转录起始位点上游-124 bp和-146 bp的2个位置，即突变-124G>A(chr5:1,295,228C>T)和突变-146G>A(chr5:1,295,250C>T)，通过在TERT启动子区内产生ETS转录因子家族的结合位点(GGAA)而赋予TERT启动子区增加活性的能力[18]。虽然TERT启动子突变在PTC中罕见，并且克隆并不活跃，但其在晚期癌症中经常可以被检出并且处于活跃的复制期[19]。TERT启动子突变与甲状腺癌恶性程度和预后有密切关联，该种突变在具有高侵袭性的FTC和PTC中更为常见，且明确提示预后不良。如果该突变与BRAF突变、RAS突变等其他致癌突变等同时出现，则提示肿瘤的侵袭性高并且预后较差， 如TERT 启动子突变-124G>A和BRAF V600E突变的共存会导致更差的预后[20]。TERT启动子突变同时也是PTC患者死亡的重要指标；相反，无TERT突变预示着PTC患者有更长的生存期[21]。

1.5 p53基因研究[4]显示：几种肿瘤抑制基因(p53、Rb、p16和p21基因，分别编码P53、Rb、P16和P21蛋白)的改变与甲状腺癌发生有关，大部分的p53突变导致蛋白质表达发生改变。其中最受关注的是位于17号染色体短臂上的p53基因，p53突变在多种人类癌症中均有发生[22-23]。p53位于17号染色体的短臂(17q31)，编码的P53蛋白的主要生物学作用是调控细胞周期中在G1期发生的DNA损伤，从而维持细胞正常生长，抑制细胞恶性增殖。突变后的p53基因无法完成这一过程，进而导致细胞的恶性转化。各种侵袭性强的特殊PTC亚型、低分化型甲状腺癌(poorly differentiated thyroid carcinoma，PDTC)和ATC中常可检测出p53突变或者P53蛋白异常[24]。p53基因突变与甲状腺恶性肿瘤的去分化有关联，多提示预后不良[11]。Balta等[25]跟踪调查了87例甲状腺肿瘤患者(包括47例PTC和40例良性肿瘤)的预后情况，随访期长达10年，并对甲状腺肿瘤患者进行了4种癌基因蛋白的检测，结合病理学检查结果发现：PTC患者细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和P53蛋白表达水平明显增加，并且对于疾病的预后有着指示性作用；PCT患者bcl-2和C-erB-2蛋白表达水平虽然也明显增加，但是其表达水平与疾病预后不良无明显的相关性。CyclinD1和P53蛋白可作为指示PTC预后不良的指标。p53突变不存在于正常的甲状腺组织或者良性病变中，包括甲状腺滤泡腺瘤、慢性甲状腺炎和甲状腺囊肿[26]。p53突变或P53蛋白异常可用于判断预后并为靶向治疗药物提供靶点。

1.6 其他基因甲状腺特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活体 γ(PAX8-PPARγ)重排是第2、3 条染色体t(2；3)(q13；p25)基因易位的结果。PAX8/PPARγ基因重排广泛存在于甲状腺疾病中，常见于FTC中，也可见于少数PTC和滤泡状腺瘤中，而且在年轻甲状腺癌患者中常显示出更高的阳性率，血管浸润转移率也相应增高[27]。基质金属蛋白酶(MMPs)如MMP2和MMP9基因表达上调可导致PTC细胞侵袭性增强，在肿瘤发生过程中起重要作用[28]。有研究[29]显示：联合检测环氧化酶2(COX-2)和MMP9可以作为PTC术前诊断和判定有无淋巴结转移的一项有效生物学指标。其他基因包括缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、Wnt/β连环蛋白(β-catenin)、核因子κB(NF-κB)和EIF1AX等也与甲状腺癌的发生发展和预后有一定的关系[30-31]。此外，有学者在80例甲状腺癌患者肿瘤组织中的57个表观遗传调控基因中发现了93个突变，且9个基因具有多突变，其中MLL(1.7%)、ARID1B(1.0%)和MLL3(1.0%)突变最常见，这些突变也许预示了甲状腺癌相关基因未来的研究方向[32]。

2 甲状腺癌的分子检测和诊断意义

2.1 分子检测方法临床上现有的单基因突变检测方法主要有以下几种：①直接测序法，即Sanger测序，也称之为第一代基因测序。利用双脱氧链末端终止法，其基本原理为双脱氧核苷三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR延伸所需的3′-羟基，因此当DNA链加入分子ddNTP，延伸就此终止。模板、引物和4种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不一的DNA片段，随后进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳得到不同的放射性条带，从而能够读取相应双链DNA的序列。在临床上应用时需要PCR仪、电泳仪和测序仪，可以直接读取序列，明确突变类型，本方法也是基因突变检测的金标准。缺点是对检测条件、组织质量和技术水平要求较高，并且耗时长(2～3 d)，敏感性不足(需要组织中突变体达到20%～30%)，且产物纯化不可控[33]。②荧光定量PCR。该方法提取肿瘤组织DNA后，将样本分别加入独立的试管中并放入实时PCR仪，待反应完成后将突变与对照反应得到的反应曲线进行比较从而完成分析，应用Taqman探针的原理，利用带有荧光标记的Taqman探针与突变基因的杂交反应来分析样品。荧光定量PCR只能针对固定的已知突变进行检测，具有耗时短、操作简便、分析结果直观和敏感性相对较高(可检测有10%的突变率)等优点。但是该方法需要精确的反应条件，优化条件较为复杂。该方法可用于检测KRAS基因突变和表皮生长因子受体(EGFR)基因突变等[34]。③突变阻滞扩增法(amplification refractory mutation system，ARMS)，即等位基因特异性PCR结合Taqman探针对突变基因进行检测。原理为通过对突变DNA模板设计突变正向引物使突变DNA成功延伸，与Taqman探针结合后发出荧光信号达到检测目的。而野生型DNA则无法与突变正向引物相结合，从而无法延伸，不能发出荧光信号，使用实时PCR仪可以完成这一过程。该方法在荧光定量PCR的基础上设计相应引物，可以对样本进行富集，提高灵敏度(可检测1%的突变率)，但是其价格很贵，由于灵敏度过高可能会导致假阳性，并且只能检测有限的几种突变，目前ARMS法可用于检测BRAF V600E突变、KRAS突变和EGFR突变[35]。

2.2 分子检测对甲状腺癌临床诊断的意义检测甲状腺癌分子标志物对于甲状腺癌的早期诊断具有广泛的意义和应用前景，可以预测甲状腺癌的发病率并且为后续治疗和预后估计提供便利，还可以协助FNAB来提高诊断结果的准确性。现可以对BRAF基因、RET/PTC重排和RAS基因等进行检测，也有许多研究已经发现了其他基因如TERT基因和p53基因等在甲状腺癌诊断和预测中的潜能。

BRAF基因点突变对于PTC是一个准确度极高的分子标志物，其检出率可达83%，是甲状腺癌中最常见的分子标志物[36]。同时，FNAB联合BRAF V600E检测能提高PTC的诊断敏感性和特异性[37]。因此，对于PTC患者， FNAB联合BRAF V600E检测是一种更加可靠的诊断手段，并且术前测试BRAF V600E对指导手术切除范围有着重要意义。同时，BRAF V600E突变的发生明确提示PTC预后不良，BRAF V600E作为一个潜在的PTC预后指标在以往的研究中已得到证实。研究[38]显示：BRAF V600E突变占PTC总患病人数的45.7%(845/1 849)，但是在56例PTC死亡病例中，有45例(80.4%)BRAF V600E突变为阳性，说明BRAF V600E突变与PTC患者死亡有关联。

RET/PTC重排在早期甲状腺癌中有较高的表达水平，该基因检测辅助FNAB的应用是临床预测PTC的重要指标，提高了分子标志物检测的灵敏度，RET/PTC重排可以成为FNAB的补充性诊断依据[39]，并且对于儿童PTC和因辐射所致的PTC有一定的指导意义[40-41]。除此之外，RET/PTC重排不仅出现于PTC中，还可见于一些良性疾病如桥本氏甲状腺炎和良性甲状腺结节中，能够有效地对以上疾病的发生和发展进行预测或者病因学的推断。

在对RET突变进行基因筛查中了解到，RET基因突变携带者患多发性内分泌腺瘤2型(multiple endocrine neoplasia 2a，MEN2a)综合征的风险增加，该疾病表现为同时发生MTC、嗜铬细胞瘤和甲状旁腺增生。MEN2a占所有遗传性MTC的80%，可以预见：对RET基因突变进行筛查可以早期预测和诊断FMTC[42]。

RAS突变阳性的甲状腺癌偏向于FTC和滤泡型甲状腺乳头状癌(follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC)，二者在形态学评估时很有可能会出现混淆而导致假阴性结果，所以RAS突变的检测在FTC和FVPTC患者的诊断过程中有很高的价值，尤其是在有FNAB样本的前提下。因此，采取措施对RAS基因进行筛查，对指导甲状腺癌的治疗也有重要的意义。Gupta等[43]对于来自66位患者的68例样本进行分析得出结论：多数RAS基因突变阳性的甲状腺癌患者缺乏确切的超声诊断标准，且多为组织学上低分化的PTC，并且常为甲状腺双侧癌。所以在临床上可以对术前行甲状腺细针穿刺检测RAS基因阳性的患者行甲状腺全切术，但是对于是否要进行预防性的淋巴结清扫尚无明确的结论。RAS基因在甲状腺癌中的出现与BRAF基因在一定程度上是互相排斥的，可用于检测BRAF V600E突变阴性的甲状腺肿瘤，从而评价肿瘤的良恶性。An等[44]分析了155例BRAF V600E阴性的甲状腺肿物(包括90例良性结节和65例不确定结节)的RAS基因第61位密码子突变，用以评估RAS基因突变诊断恶性肿瘤的准确性，结果显示：在65例未定性BRAF V600E阴性的甲状腺肿物中，25例出现RAS基因突变，占总数的38.5%。其中18例NRAS突变(72%)，7例HRAS突变(28%)；90例细胞学判定为良性的肿瘤中只有5例RAS基因检测为阳性；在25例RAS突变阳性的未定性结节中仅2例超声诊断结果为恶性(8%)；在15例接受手术的NRAS阳性未定性结节患者中有14例术后病理结果为恶性，包括13例FVPTC和1例FTC。该研究结果表明：RAS基因突变分析可作为在细胞学和超声诊断中不确定以及BRAF V600E阴性的FVPTC的术前诊断工具。另外，对于甲状腺结节患者，出现RAS突变阳性表示病变为恶性的概率较大[45]。研究[46]显示：RAS突变患者中远端转移的频率增加，但是由于大多数研究的统计数量较少和随访期限较短，尚不可能确定RAS突变本身具有预后价值。

TERT启动子突变对于甲状腺肿物FNAB结果模糊不清的结节具有潜在的诊断意义，对TERT基因检测的特异性高(约100%)，但敏感性却极低(约7%～10%)；当TERT启动子突变与其他基因突变联合检测时，尤其是与BRAF V600E和RAS突变联合检测时，其敏感性可明显提高[47]。

目前，FNAB是评估甲状腺结节的金标准，但约20%～30%的甲状腺结节无法被FNAB明确诊断，通常被报道为良恶性不确定。由于对此类结节缺乏明确的诊断手段，临床上建议大部分患者接受诊断性手术从而确定疾病的性质。临床上已经开展了对于疑似甲状腺癌患者进行一些基因检测，以便对不确定的结节进行倾向性预测，用来辅助诊断和治疗。但基因诊断尚未作为一项独立的诊断方法在甲状腺癌的诊断中起到核心作用[3]。

在此基础上发展更多的相应基因检测手段也十分重要，成功地检测出各种标志性基因对于早期甲状腺癌的诊断有着重要意义。目前，对于甲状腺癌的诊断不能独立于某项单一的标准，多基因联合检测比单一基因检测更能提高诊断准确率；对FNAB组织进行多个基因的联合检测能够更早地发现甲状腺癌，并且预测高风险人群，从而选择更加合适的治疗手段，完善个体化治疗方案。现有的基因检测及分析手段在基因筛查中显示出较高的特异性，但是在敏感性上依然有欠缺。未来会有新的更加高效准确的基因检测手段对现有的甲状腺癌相关基因以及一些新的突变进行检测，在临床上起到预测和诊断的作用[48]。

总之，甲状腺癌病因学研究尚不明确，主要致病因素并不十分清楚。随着甲状腺癌分子生物学研究的进展，将会认识到更多甲状腺癌基因层面的发病机制，并且出现更加有效率的检测手段。