内生菌发酵工艺的研究进展*

★ 史毅 陈文彬 张博文 郑红梅 柴华文 叶耀辉*（江西中医药大学药学院 南昌 330004）

植物中所包含的丰富的次生代谢物，是天然药物开发的宝库，从植物中筛选药用活性物质已成为炙手可热的研究方向。植物内生菌具有种类多、分布广、生物学功能多样等诸多优点，并在寄生于宿主植物的过程中，自主产生一系列具有杀虫、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤及免疫抑制等药用作用的活性物质。因此，从植物内生菌中寻找并开发新的生物活性物质已成为当今生物学研究的热点。近年来，借助于生物发酵相关工程技术具有发酵周期缩短、能耗减小、生产成本降低、菌体生长加快、副产物减少、产物产率提高且发酵工艺简单，过程易实现自动化控制等诸多优点，进一步地开发了植物内生菌发酵工艺的应用前景。由于每种内生菌具有各自不同的菌种的特性，因而需要提供不同的发酵条件才可以帮助其生成发酵产物。故而当前研究者在研究内生菌的发酵工艺时，主要围绕发酵工艺优化展开，包括培养基的不同营养成分（碳源、氮源、微量元素等）以及发酵条件（温度、pH值、溶氧量等）。

1 内生真菌发酵种类的研究

内生真菌的发酵方法研究主要包括液体深层发酵和固体发酵，前者占用空间小、周期短、产物生成量大、可分离纯菌丝体、成本低等；后者则设备简单、发酵条件易控制、培养物中各成分均可得到充分利用等。两种发酵方法各自具有不同的优点，可根据其发酵目的选择性使用。液体发酵主要用于内生真菌的活性产物或提取物的相关研究中，如曾茜等［1］借助于液体发酵的方式来对蒿属植物中的内生真菌Penicillium sp.具有抗癌活性的产物进行了相关研究；都晓伟等［2］采用了内生菌液体发酵的方式来提高穿山龙提取物中薯蓣皂苷元的含量；而固体发酵则主要侧重于研究培养基配方的优化及产物的分离鉴定情况，如李信军等［3］对两株内生真菌菌株的固态发酵培养基配方进行了优化；张瑶［4］采用固态发酵的方式研究了白木香内生真菌发酵产物的分离鉴定情况。

目前随着将中药运用于药用或食用真菌的发酵基质，一种新型的固体发酵方法也油然而生［5］。当具有活性成分的药性基质被药用真菌发酵时，不仅可以提供真菌生长所需的营养物质，促进其大量生长，还能够因为真菌的酶而改变其原有的组织成分，因此该种发酵方式具有双向性。如当药用人参在灵芝中发酵时，随着一系列复杂的生理活动及生化反应，将会产生新成分与新功能［6］。庄毅等［7］就借助了双向性发酵工程发现了新药槐芪菌质。并发现槐耳菌和黄芪组合发酵后所生产的槐芪菌质所提成分具有保肝、促进机体免疫功能及抗病毒等药理作用。

2 培养基对发酵的影响

内生菌发酵的培养基主要被用于为内生菌生长或者代谢提供所需的能量及营养物质，其成分的组成不仅会对菌体的生长和繁殖能力及发酵物的生成效率造成直接性的影响，而且还会对发酵产物的产量及质量造成严重的影响［8］。通常情况下，培养基的成分会根据菌体的品种、发酵条件的差异及发酵阶段的不同而进行选择。在培养基中直接影响其质量的四大营养要素分别为碳源、氮源、无机盐以及生长因子［9］。

2.1 培养基中碳源成分对发酵的影响培养基中的碳源成分是被用来为微生物提供能量、辅助细胞结构及产物的生成。碳源主要是由单糖、双糖、多糖、油脂、天然复合物等成分所构成，淀粉、葡萄糖、蔗糖等是最为常用的碳源。适宜的碳源种类和浓度将会直接对菌体生长和芽孢生成造成影响［10］。李莎莎等［11］在对芽孢杆菌的生长研究中发现该菌对有机碳源玉米浆的利用效果最好，培养24h后菌量可达到3.58×108CFU/mL。刘超等［12］在对菌种不同碳源的利用情况的研究中发现，菌株XP-8无法利用单糖中的苹果酸；而对各个碳源的利用能力分别为麦芽糖＞葡萄糖＞木糖＞可溶性淀粉。白建军等［13］研究发现，沙棘根瘤内生菌对碳源要求比较严格，多数只能利用丙酸或葡萄糖、吐温等。李倩玮等［14］选用7种类型的培养基对花生种子中内生细菌进行分离，结果表明，选择牛肉膏蛋白胨培养基分离得到的内生细菌最多，有57株，而以乙烯（ACC）为唯一碳源的内生细菌最少，为23株。

2.2 培养基中氮源成分对发酵的影响氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源。氮源主要分为有机氮源和无机氮源，包括蛋白质、核酸、氨基酸、硫酸铵、硝酸铵、等。由于铵盐中的氮与细胞中的氮处于相同的氧化水平，故比较之下无机氮更容易被菌体快速吸收利用［15］，虽然有机氮延长了菌体的吸收利用时间，但有机氮可以显著地促进菌体增殖和芽孢的生成。总体来说，菌体酶系在生长初期没有构建完整时，无机氮源会帮助菌体对营养成分的吸收利用；然而在后期酶系完善构建后，则菌体会分解并利用富含更多营养物质的有机氮源。

除了碳源、氮源的构成种类对菌体产生影响外，适宜的碳氮比也会对其产生一定的影响，不当的碳氮比会使菌体按照一定的比例对营养物质进行吸收，将会抑制菌体的正常生长和产物的合成效率。因此有效地调控培养基成分中的碳氮比，可以帮助菌体的生长，提升产物的生成效率。Idris等［16］研究发现，以ACC为唯一氮源的内生菌的比例（36%）较根际微生物的比例（20%）高。郭伟等［17］研究发现不同氮源培养基中，蛋白胨作为氮源时菌落生长最快，培养20d后菌丝体增至6.47mm。王晓洋等［18］在不同氮源对菌株溶磷效果比较实验研究中，得出四株内生细菌在以以硫酸铵为氮源的培养基中溶磷效果最佳，W3溶磷能力最强，且改变无机磷基础培养基中碳氮比对菌株W3的溶磷效果有影响。

2.3 培养基中无机盐成分对发酵的影响培养基中的无机盐成分会直接影响微生物的正常生长及产物的生成。研究表明，当金属离子的浓度过低时，会促进菌体的生理活动，当浓度过高时则会阻碍微生物的正常代谢及繁殖。比如无机盐中的磷元素，参与了微生物的生理代谢活动并构成了细胞中核酸等辅酶的生成。江明明等［19］把所得的内生菌菌悬液接种于NBRIP无机磷固体培养基中，在28℃培养箱中培养2～5d，通过有无解磷圈的生成及生成解磷圈的大小来评价内生菌的解磷能力。无机盐中的钙离子不仅可以调节细胞的生理状态，而且可以提高发酵的含菌量，促进菌体发酵时的效率。除上述提及到的无机盐外，锌、镁、钴、钼、锰以及铁等元素都是微生物赖以生长的微量元素，均在一定程度中影响发酵产物的生长情况。林星辰等［20］在优化人参内生菌B69抑菌活性产物的发酵条件中，从11种不同的无机盐组合中筛选了最适合其生长的无机盐条件为0.5%的NaCl。宋歌等［21］在将无机盐培养基中添加污染物作为唯一碳源筛选时发现，菌株CPY-4和菌株SGL-1可以在只提供4-BDE的无机盐培养基中存活，菌株CPY-4，SGL-1、菌株4、菌株13可以在提供BDE209和aroclor1254的无机盐培养基中存活。

3 培养条件对发酵的影响

除了培养基对发酵具有重要的影响外，发酵条件在对于菌体的生长中也发挥了重要作用，适宜的培养条件，不仅有助于菌体的生长繁殖，而且可以提高微生物对底物的利用能力，使代谢朝向有益于发酵产物的生成进行。因而通过调控发酵条件（溶氧量、温度、pH值等），能够为菌体的生长创造适宜的环境，从而提升微生物的繁殖能力、获得质量更高的发酵产物。

3.1 温度对发酵的影响温度作为影响内生菌代谢生长过程中至关重要的影响因素，在发酵培养过程中将会对内生菌细胞质膜的流动性、物质的溶解及酶活性产生重要的影响。当培养的温度过高时，会一定程度内破坏适合菌体生长的平衡环境，进而阻碍菌体的正常生长，此外温度过高也会导致菌体中的蛋白质成分发生凝固及变性，甚至造成菌体死亡；当温度过低时，也会严重影响菌体的正常生长，因此在发酵培养菌体的过程中需要为菌体的生长创造合适的温度环境［22］。

温度除了受菌体种类的影响外，还会由于产物的不同而所需的温度不同。在优化发酵温度的阶段中还需要综合参考其他的发酵条件及因素，例如能源消耗、发酵周期、产率水平和培养基成分等，必要时还可以考虑变温培养。王壮等［23］在筛选五味子叶枯病菌拮抗放线菌A-25-8的发酵温度条件时，选择了温度为25℃、28℃、31℃和34℃等4个梯度，最终得出28℃为该菌的温度最佳条件。李艳宾等［24］以产黄酮甘草内生真菌YF-A为研究对象，在研究发酵温度对其发酵影响时，发现该内生真菌的最佳发酵温度为32℃。李娟等［25］发现菌株X对病原菌的抑制率随温度的变化基本上呈倒钟型，从24℃到28℃，随着温度的升高，其体内生化反应速率上升，其抑制率也逐渐上升，由28.34%升高到46.57%。

3.2 pH值对发酵的影响pH值是确保菌体正常繁殖、代谢的重要参数，选择合适的pH值将会对不同种类的菌体生长及发酵产物的合成造成重要的影响。其主要原因在于：（1）pH值可以通过影响菌体内各种酶的活性，来进一步地对菌体的生长繁殖和新陈代谢造成影响；（2）pH值能够通过影响培养基中某些重要的营养物质的利用率及中间代谢产物的解离来间接地影响内生菌对于营养物质的吸收和利用［26］；（3）pH值可以改变原生质膜的电荷，从而使细胞膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性均受到了一定的影响，最终影响了菌体对于营养物质的吸收，抑制了菌体的生长速率［27］；张涛等［28］人在探究烟草黑胫病拮抗菌的抑菌实验中发现，在pH3～6（酸性条件）时抑制效果较差，7～9（中性或弱碱条件）时抑制效果较好，其中以pH7.6（自然）对烟草黑胫病的抑制作用最好。李欣等［29］研究拐枣七的茎部内生细菌GZJR-8时发现，该菌发酵最适pH为7.5～8。

3.3 溶氧对发酵的影响在好氧真菌的发酵过程中，通常会通过控制溶氧量来达到调控发酵的目的。溶氧不仅能够为菌体的正常生长及代谢提供所需的氧气，而且它还会对菌体次生代谢产物的合成途径及合成速率造成严重的影响。若供氧不足，则会造成内生菌无法正常的吸收代谢营养物质，甚至会影响发酵液中的酸碱度，进而促进了有毒物质的生成，此外，供氧不足还会抑制发酵产物形成前的前体物质的积累，从而阻碍了菌体的生长及代谢产物的合成。菌体发酵过程中的供氧一般是通过调节通气量、搅拌速度、转速、装液量等来实现的。

周宁等［30］在对甘蔗叶产黄酮内生真菌的研究中，通过转速来调节发酵过程中的溶氧量。当摇床转速由100r/min升至125r/min时菌丝体生物量明显增加，当转速达到125r/min时有最大生物量积累，超过125r/min时生物量缓慢下降。当转速缓慢时，培养基内的溶解氧也会随之减少，这不仅会影响菌丝的生长，同时也会导致代谢产物产量降低；当转速增加时，培养基发酵液中的溶氧量也显著增加，但倘若转速过快时，由于强烈的机械刺激，会促使细菌发生机械性的损伤，会严重抑制菌丝和产物的产量。叶云峰等［31］人研究发现在众多影响枯草芽抱杆菌B47产抗菌物质的因素中装液量的影响力是最强的，随着装液量的减少菌体生成产物的能力逐渐增强，由此可见装液量（溶氧）对菌体产物的生成是成正相关的。一般情况下，发酵培养液中装液量越少，溶氧量就越大。较少的装液量有益于提高溶氧，但是太少也会因为营养物质的缺乏而阻碍菌体的正常生长；较多的装液量能够为菌体的繁殖供应足够的营养，但另一方面会导致溶氧能力下降，不足以维持菌体增殖所需要的氧分［32］。

虽然目前在国内外已经有很多的研究者研究了溶氧条件的优化，但关于内生菌发酵系统中氧传递的相关研究甚少，尤其是对如何在使用生物反应器来进行大规模发酵时借助通气和搅拌来增加发酵液中的溶氧还鲜见研究，因此未来关于对氧传递方面的研究将会为后续指导反应器放大工作产生重要的影响。

3.4 发酵时间对发酵的影响发酵过程中选择合适的培养时间不仅节省了整个发酵工艺时间，而且还降低了发酵成本。柏钰等［33］选用了8个发酵时间点来测定发酵罐和摇瓶培养发酵液的抗菌作用，结果显示当罐发酵3d时每100mL发酵液中菌体生物量达到最高（1.65±0.052）g，4d时抗菌活性最高为（33.56±1.34）%；而摇瓶发酵在5d时每100mL发酵液中菌体生物量达到最高（0.82±0.035）g，7d时抗菌活性最高为（53.20±0.76）%。由此找出了最适宜的发酵条件，为发酵优化奠定了基础。发酵的培养时间优化通常都是通过设定不同发酵时间梯度来确定最适宜发酵时间的，如史云峰等［34］在研究优化皱边石杉高产HupA功能内生菌发酵培养基最佳时间时，分别在4个不同的时间点设置了两个平行样，恒温振荡培养测定HupA的产量。

在调控发酵培养条件时，除了能够对温度、pH、溶氧、发酵时间进行改变外，还可以通过改变接种龄来实现。接种龄是指从菌丝接种于种子罐到将其转移到下一级种子罐或发酵罐间的时间。若接种时种龄偏小，则会导致发酵前期菌体生长变缓、发酵周期被延长、发酵产物生成时间被拖延，甚至会引起异常发酵的情况发生。若接种时种龄偏大，亦会加快菌体消耗培养基的速度，诱发菌体快速生长，进而使得菌体过早自溶，因此，选择适当的种龄是非常重要的［35］。

4 优化内生菌发酵工艺的方法

在研究内生菌发酵工艺的优化问题时，通常会结合统计学的方法来调控各个影响内生菌发酵产物的因素，使发酵效率得以提升，最终系统、高效、低成本的获得内生菌发酵产物。就目前来看，在优化发酵工艺时普遍应用正交实验设计法，但随着统计方法的发展，出现了Plackett-Burman试验设计方案筛选并结合响应面设计法，两者共同应用优化发酵工艺。

4.1 正交试验设计法正交实验设计法是采用正交表对多因素进行分析的一种数理统计方法，在一个实验中设定多个因素和变量，通过对比分析找出符合实验条件的最佳他因素组合。采用正交试验设计法可以很好地判断影响微生物发酵的主要因素。该法具有方法简单、效率高以及工作量小等特点，进而广泛应用于内生菌发酵工艺的优化。马冠华等［36］通过正交实验设计法对烟草内生细菌Itb57的发酵条件进行优化，对5个实验因素进行4因素正交实验设计，共进行16个因素组合实验，确定了烟草内生细菌Itb57的最佳发酵条件：初始pH值7，培养时间72h，恒温28℃，摇瓶转速180r/min，装液量25mL/500mL每瓶。

4.2 响应面设计法响应面设计法（Response Surface Methodology，RSM）是将试验设计、统计分析、数学建模等方法结合来对相关数据进行分析，并利用多元二次回归方程在因素和响应值之间建立函数关系的拟合，从而优化工艺参数。响应面设计法是解决多变量因素的最为简单有效的试验方法其中最为常用的方法是Box-Behnken设计（Box-Behnken Design，BBD）和中心组合设计（Central Composite Design，CCD）［37］。目前研究中，响应面设计法通常会结合Plackett-Burman试验来筛选影响发酵结果的重要因素，实现高效提升发酵产物产量的目的。孙力军等［38］在研究金银花内生菌EJH-1时，采取了Plackett-Burman和响应面等设计法优化了金银花内生菌EJH-1产生抗菌作用的培养基。何璐等［39］利用Plackett-Burman分析法设计试验，选择影响的主效应因子，用统计学的原理、对试验数据进行极差分析，最后利用RSM分析法，得到了苦参内生真菌BS001菌株的最佳发酵条件。

5 内生菌发酵工艺目前的缺点及今后的研究进展

科学技术与生物技术水平的快速发展使得内生真菌发酵技术在医药行业、农业、工业、食品业中得到了普及应用，相信在未来能够利用内生菌发酵技术来解决更多的生产难题。不断运用内生真菌发酵技术，探索、优化、改进发酵工艺能够大幅的提升工作效率，并促使发酵工程技术往更为广泛的领域发挥应用价值［40］。近年来，内生真菌的发酵生产越来越显示出了巨大的发展前景，而且发酵工艺也到了有效的改进，基于高产菌种选育、发酵条件优化等方法的改善使得内生真菌产活性物质的能力获得了颠覆性的提高。然而，目前的研究项目大都停留在实验室阶段，很难使大规模的发酵生产在中、大型企业中的到工业化的发展［41］。探其因由在于缺乏适于工业化大规模生产的高产菌株，

以及发酵策略未能系统的调控。因此，寻找高产内生菌株和建立系统性的内生真菌发酵工艺控制流程，将成为今后最重要的研究方向。