耳蜗干细胞移植联合中药干预对感音性耳聋治疗效果的影响

周 卫，何庆文（武汉市第六医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 430015）

据相关统计数据显示，我国绝大部分听力语言残疾者均为感音性耳聋[1-3]。感音性耳聋常见的病因多为耳蜗与耳蜗后等部位出现病变，如噪声性聋、药物中毒性聋、老年性聋、先天性感音性耳聋等[4-6]。由于人类毛细胞的再生能力相对较弱，再加上毛细胞的损伤不可逆，故感音性耳聋在临床上的治疗一直比较棘手。近年来，有学者研究报道称用中药加以干预对感音性耳聋治疗能有效解决上述问题[7-8]。本文旨在探讨耳蜗干细胞移植联合中药干预对感音性耳聋治疗效果的影响，为临床上感音性耳聋患者的治疗提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设计 随机选取正常健康成年并且耳廓反射灵敏的豚鼠120只，雌雄兼有，清洁级，体质量（221±32）g。其中20只含药血清制备，100只用于造模；另外选20只刚出生豚鼠（P0）用于耳蜗干细胞的培养，体质量为（6.1±0.6）g。将感音性耳聋豚鼠分成空白对照组，耳蜗干细胞移植组和干细胞移植+中药干预组，实验设计为随机对照动物实验。

1.2 主要试剂及仪器 美国Sigma公司生产的胰蛋白酶、MyosinⅦA抗体、Nestin抗体、BrdU抗体，美国Gibco公司生产的碱性成纤维生长因子、B27、胎牛血清。金坛市恒丰仪器厂生产的恒温水浴箱；美国Healfare公司生产的二氧化碳培养箱；吴江市净化设备总厂生产的净化等级100级超净工作台；德国Leica公司生产的荧光显微镜、倒置显微镜以及丹麦生产的听觉脑干电位仪。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及建模 取清醒状态下的双耳听阈正常的豚鼠放于笼内，并将其固定于消声室自由声场中。其中豚鼠双耳距离脉冲噪声声源（间隔时间为20 s，脉宽为0.25 ms，压力峰值为180.0 dB SPL）15 cm，暴露次数为300次。在完成噪声暴露后1周，对上述豚鼠进行ABR相关测试，并将20、16、8、4 kHz各频率，豚鼠双耳ABR阈值不小于60 dB SPL的豚鼠选为此次研究的备选动物。随机将感音性耳聋豚鼠分成空白对照组（n = 30），耳蜗干细胞移植组（n = 30）和干细胞移植+中药干预组（n =30）。

1.3.2 干细胞培养 取20只出生不久的豚鼠，使用2 mL 10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉后将内耳耳蜗取出，并将相关血管及表面结缔组织去除，将Corti器进行分离，反复用HBSS液进行多次冲洗，然后剪成碎片，在37 ℃下用胰蛋白酶将上述碎片进行消化，25 min后用铜网（200目）进行过滤，将滤液置于离心机上进行离心4 min，转速设置为1000 r/min，并用吸管对离心后的滤液进行轻柔吹打，装入培养瓶，置于体积分数为5%、环境温度为37 ℃的CO2细胞培养箱中，半量培养基每隔3 d进行一次置换，每隔7 d左右进行一次传代，免疫荧光鉴定以BrdU和Nestin进行。

1.3.3 归芪地黄汤含药血清 归芪地黄汤中包括当归、黄芪、泽泻、茯苓、山药、牡丹皮、山茱萸、熟地黄8味药，根据相关成方常用剂量（2:4:3:3:3:4:4:8）进行配伍而成。在1～6 d早晚各以剂量为20 mL/kg灌胃方式给实验豚鼠给药，经眼眶采血在第7天一次给药全天剂量后1 h进行。并将所采集的血液置于4 ℃环境下静置1 h，然后置于离心机上进行离心20 min，转速设置为1 000 r/min，将上述分离后的血清置于56 ℃进行灭活30 min后过滤分装，滤膜为微孔滤膜，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.4 耳蜗干细胞移植 干细胞移植在造模后3个月进行，将豚鼠麻醉后切开左耳后分层，钻取耳蜗底周鼓阶外侧壁下方一个0.2 mm的小孔，经小孔注入细胞浓度为4.0×108/L的 细胞悬液10 μL；对照组注入生理盐水作为空白对照；干细胞移植+中药干预组则注入细胞浓度为3.5×108/L含药血清的细胞悬液10 μL（体积分数为10%）。完成注入后，对钻孔进行封堵，将切口逐层进行缝合，术后并予抗生素预防感染。

1.3.5 听阈测试 在完成耳蜗干细胞移植后7 d，28 d，56 d，10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉后固定豚鼠，

在其颅顶放置记录电极，左耳乳突放置参考电极，右耳乳突放置接地电极，使用交替短声（0.10 ms）对豚鼠进行刺激。对相关ⅴ波波形及阈值进行观察记录。1.3.6 免疫荧光染色 以Nestin免疫荧光染色鉴定培养干细胞成功后，使用BrdU对细胞核进行标记移植，用MyosinⅦA免疫荧光染色检测在完成标记移植后7 d、28 d、56 d分化的毛细胞，使用荧光显微镜进行镜下观测，并对镜下视野均值进行计数。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学软件对本次数据进行统计学的分析，采用均数±标准差（）表示计量资料，并采用方差分析的方法对组间计量资料的数据进行分析。P＜0.05为组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 感音性耳聋模型 经过连续噪声刺激后实验豚鼠出现不同程度的听力下降、体质量下降以及烦躁，在完成噪声暴露后1周，对上述豚鼠进行ABR相关测试发现均不小于80 dB SPL，显微镜镜下可见内耳毛细胞部分出现死亡、萎缩和倒伏见图1（插页二）。

2.2 耳蜗干细胞的鉴定及培养 在荧光显微镜下可见原代豚鼠耳蜗干细胞在培养皿中生长状况良好，单细胞外观呈类圆形，培养至4 d后有成团趋势，见图2（插页二）；干细胞经Nestin荧光染色检测显示为阳性，此细胞增殖良好，经BrdU标记细胞核后确定所培养皿中生长的细胞为干细胞。

2.4 免疫荧光检测结果及ABR阈值测定 耳蜗干细胞移植组和干细胞移植+中药干预组在进行干预后均可观测到MyosinⅦA阳性细胞及Nestin 阳性细胞，与耳蜗干细胞移植组比较，干细胞移植+中药干预组的MyosinⅦA阳性细胞及Nestin 阳性细胞数量显著升高，经比较2组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）；在进行干预后，耳蜗干细胞移植组和干细胞移植+中药干预组ABR 检测数值均出现下调，与耳蜗干细胞移植组比较，干细胞移植+中药干预组豚鼠的听力显著改善。

3 讨论

感音性耳聋会对患者的学习、人际之间的交往、生活、工作产生不同程度的影响。若2岁前小儿发生感音性耳聋，聋哑症的发生率将会大大提高[9-11]。归芪地黄汤是由当归、黄芪、泽泻、茯苓、山药、牡丹皮、山茱萸、熟地黄8味药根据相关成方常用剂量进行配伍而成[12-13]。有学者研究报道称用中药加以干预对感音性耳聋治疗能有效解决上述问题[14]。

研究结果显示，在免疫荧光检测结果方面，耳蜗干细胞移植组和干细胞移植+中药干预组在进行干预后均可观测到MyosinⅦA阳性细胞及Nestin 阳性细胞；2组豚鼠鼓阶内Nestin阳性细胞球数量均随着时间的延长而出现逐渐的下降，但与耳蜗干细胞移植组比较，干细胞移植+中药干预组的MyosinⅦA阳性细胞及Nestin 阳性细胞数量显著升高，经比较差异具有统计学意义（P＜0.05），提示归芪地黄汤干预感音性耳聋可以明显提高耳蜗干细胞的存活率，效果较为明显；通过对豚鼠ABR 阈值进行检测本研究还发现，在完成耳蜗干细胞移植后28 d 耳蜗干细胞移植组和干细胞移植+中药干预组的听力恢复迅速，速度到达峰值，ABR阈值下降速度也相应达到最大。在完成干细胞移植后的56 d 对2组豚鼠ABR阈值进一步进行检测发现听力均有相应进一步的好转，但幅度较缓。与耳蜗干细胞移植组比较，干细胞移植+中药干预组豚鼠的听力显著改善。在完成耳蜗干细胞移植后7 d对3组豚鼠ABR阈值进行检测发现，与空白对照组相比，耳蜗干细胞移植组和干细胞移植+中药干预组阈值出现轻微的下降，但3组阈值差异不大，无统计学意义。我们分析，这与在完成耳蜗干细胞移植后7 d干细胞分化为毛细胞的数量相应出现减少有关[15]。后面我们也从荧光显微镜下几乎不见MyosinⅦA 阳性细胞而见到大量的Nestin 阳性细胞证实了我们的分析。另外我们发现，耳蜗干细胞在完成移植后开始大量的分化为毛细胞，在完成移植后30 d达到分化峰值，与耳蜗干细胞移植组比较，干细胞移植+中药干预组的存活率及分化率都明显升高，表明归芪地黄汤干预能够有效提高耳蜗干细胞的存活率以及分化为毛细胞的比例，具有临床应用价值。

综上所述，耳蜗干细胞移植联合中药干预对感音性耳聋治疗效果明显，归芪地黄汤干预不仅可以明显提高耳蜗干细胞的存活率，还可以明显提高其分化为毛细胞的比例，具有临床应用价值。

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