无创DNA产前检测在胎儿染色体非整倍体疾病筛查中的应用*

侯亚萍，杨洁霞，郭芳芳，齐一鸣，彭海山，王东梅，欧阳浩新，尹爱华△

(1.广东省妇幼保健院医学遗传中心，广州 511442；2.广东省妇幼代谢与遗传病重点实验室，广州 511442)

目前，我国的出生缺陷发病率为4%～6%，每年新增出生缺陷儿高达80～120万[1]，而染色体异常在其中占重要比例[2]。迄今为止，染色体异常尚无有效的治疗手段，故早期的产前筛查及诊断尤为重要。目前，预防出生缺陷广泛应用的检测手段之一是基于血清学筛查和超声筛查评估染色体拷贝数异常的风险，但该检测方法的灵敏度和准确性不高，筛查假阳性率高，产前诊断率较低[3]。而介入性产前诊断技术因其具有有创性，存在对孕妇造成宫内感染、早产、流产等风险，这也一定程度上制约了其在临床的广泛应用[4]。1997年，LO等[5]在孕妇外周血中首次发现了胎儿游离DNA(cffDNA)段，由此为无创性产前诊断奠定了坚实的基础，使利用孕妇外周血检测胎儿染色体疾病和基因疾病成为可能。随着分子遗传学及生物信息学的飞速发展，胎儿染色体非整倍体无创DNA产前检测(NIPT)技术以其独特优势已广泛用于临床。本研究通过回顾性分析广东省妇幼保健院医学遗传中心自愿行NIPT孕妇的产前筛查、产前诊断结果及妊娠结局，综合分析NIPT技术在胎儿染色体非整倍体疾病筛查领域的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年6月至2015年11月来广东省妇幼保健院医学遗传中心就诊的经知情同意自愿接受NIPT的10周以上单胎妊娠孕妇5 946例(近期未接受过异体输血、细胞治疗、移植手术等，体质量<100 kg)作为研究对象，NIPT指征情况：唐氏筛查结果异常4 525(76.10%)，B超提示异常183例(3.08%)，既往有不良孕产史186例(3.13%)，高龄889例(14.95%)，传染病19例(0.32%)，错过唐氏筛查144例(2.42%)。孕妇年龄17～50岁，平均(29.28±2.12)岁。对孕妇均提供遗传咨询并签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1血清学筛查 当天采集孕妇空腹静脉血2 mL测量胎儿颈项透明层厚度(NT)，分离血清进行测定。采用芬兰Perkin Elmer公司生产的DELFLA-1235型全自动时间分辨荧光分析仪及配套试剂检测孕妇人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)和血清甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(uE3)水平，并结合孕妇年龄、体质量、孕周、单/双胎、是否有吸烟饮酒史、采样时间等指标，应用芬兰Perkin Elmer公司提供的LifeCycle 3.2唐氏筛查风险软件进行风险评估。

1.2.2超声检查 孕妇在孕早期(11～13+6周)时采用彩色多普勒超声测量胎儿NT，测量标准参照英国胎儿医学基金会标准。若NT>2.5 mm者，建议进行NIPT或侵入性产前诊断检查，并跟踪随访妊娠结局。

1.2.3NIPT 获得孕妇知情同意且符合条件的孕妇，采用Cell-Free DNA BCTTM管(美国Streck公司)抽取静脉血10 mL，并立即在4 ℃条件下48 h内进行血浆分离并保存于-80 ℃待测。采用QIAamp DNA Micro试剂盒(德国Qiagen公司)进行血浆胎儿游离DNA提取。采用文库构建试剂盒(中国博奥公司)进行测序文库构建后，用Sequencing kit V3测序试剂盒对待测文库在Proton测序平台进行测序检测。通过分析不同染色体水平的差异识别胎儿染色体非整倍体异常，并计算出胎儿患染色体非整倍体疾病的风险概率[6]。

1.3产前诊断及随访 对唐氏筛查高危、NT异常者建议进一步行产前诊断检查，拒绝行产前诊断者可自主选择NIPT。NIPT结果提示低风险的孕妇，建议继续妊娠并在医生指导下进行常规产前检查；而结果提示高风险者，建议行胎儿染色体核型分析，以核实无创检测结果的准确性。对所有接受筛查孕妇的妊娠结局进行跟踪随访。

1.4统计学处理 本研究中所有数据均采用Excel 2007及SPSS19.0统计学专业分析软件进行分析处理，其中高通量测序检测胎儿患染色体非整倍体疾病的风险(21/18/13-三体综合征等)概率由专用的无创产前数据分析管理系统软件基于二元假设的Z-score值判断标准进行统计分析。

2 结 果

2.1唐氏筛查结果 在行NIPT的5 946例孕妇中，唐氏筛查异常者4 525例，其中21-三体高风险2 341例(51.73%)，21-三体临界高风险1 773例(39.18%)，18-三体高风险71例(1.57%)，18-三体临界高风险28例(0.62%)，其他指标异常312例(6.90%)。

2.2NIPT结果 在行NIPT的5 946例孕妇中，共检出62例异常者，其中21-三体高风险17例(27.42%)，18-三体高风险10例(16.13%)，13-三体高风险3例(4.84%)，性染色体异常15例(24.19%)，其他染色体异常17例(27.42%)。

2.3羊水穿刺检查及妊娠结局随访 见表1。结合羊水/脐血穿刺及随访结果，本研究5 946例孕妇行NIPT的结果提示异常者62例，经产前诊断及随访确诊者62例。其中2例NIPT未发现异常，但后期超声检查发现异常，经确认为18-三体综合征。本研究中NIPT胎儿21/18/13号染色体非整倍体异常的灵敏度为92.59%(25/27)，特异度为99.92%(5 914/5 919)，假阴性率为7.41%(2/27)，假阳性率为0.08%(5/5 919)。NIPT提示性染色体异常的15例中10例经羊水/脐血穿刺检查确诊为性染色体异常，而5例经进一步检测及后期随访均未发现异常。NIPT性染色体异常的灵敏度为100.00%(10/10)，特异度为99.92%(5 931/5 936)，假阴性率为0.00%(0/15)，假阳性率为0.08%(5/5 936)。在NIPT提示其他染色体异常的17例中，仅1例提示18号染色体缺失者经羊水穿刺-微阵列比较基因组杂交技术检查结果为46,XN,del(18)(q22.3)，确认NIPT结果正确，其他16例经进一步检测及后期随访均未发现异常。

3 讨 论

中国每年出生的新生儿约有1 600万，其中仅因染色体异常引起的新生儿出生缺陷约为0.6%[1,7]。临床上，胎儿染色体非整倍体是出生缺陷中的主要疾病[2]。随着国家计划生育政策放宽，高龄孕妇数量明显增多，深入开展产前诊断与筛查，降低出生缺陷，提高人口素质显得尤为重要。目前，我国针对妊娠早、中期18～34岁孕妇推行的是血清学产前筛查-产前诊断模式。在本研究5 946例行NIPT的孕妇中，唐氏筛查异常者4 525例，占总样本量的76.10%。但经过NIPT和羊水/脐血穿刺检查及妊娠结局随访结果的进一步确认可见，唐氏筛查检测结果具有假阳性高、特异度差、影响因素较多的特性和不足，故唐氏筛查异常者需进一步进行检查确认。而被誉为“金标准”的传统产前诊断方法是侵入性产前诊断技术，因其有创性、风险性，常常给孕妇及家属造成较大的心理压力而难以被广泛接受[4]。尤其现在二胎政策放开后，孕妇数量，特别是高龄孕妇明显增多，血清学筛查及侵入性产前诊断方法已远远不能满足临床及社会的需求。

由于NIPT技术具有高通量、自动化、无创、快速等特点，在国内外广受关注，且该新兴技术已广泛用于临床诊断胎儿非整倍染色体异常等方面。本研究中5 946例行NIPT的孕妇中，筛查胎儿21/18/13号染色体非整倍体异常的灵敏度为92.59%(25/27)，特异度为99.92%(5 914/5 919)，假阴性率为7.41%(2/27)，假阳性率为0.08%(5/5919)。灵敏度及特异度稍高，假阳性率及假阴性率与之相似。灵敏度及特异度偏高考虑与样本量偏小，检测标本多为唐氏筛查高危者，低风险者比例小有关。

NIPT是产前筛查手段的巨大进步，也是无创产前检测未来发展的趋势[8]。尽管NIPT具有很多优点，但目前仍存在一定局限性，需要进一步优化和改进。此外，因NIPT的对象是母体血浆中的胎儿游离DNA，并非直接获取胎儿的遗传物质，故仍存在假阳性及假阴性的风险。本研究共发现有2例21-三体假阳性，1例18-三体假阳性，2例13-三体假阳性和2例18-三体假阴性，假阴性率为7.41%，假阳性率为0.08%。初步推测可能与母体因素和胎盘嵌合有关，目前仍在进行深入验证分析工作。有研究亦认为，胎儿游离DNA主要源于凋亡的胎盘滋养细胞[9]，故限定性胎盘嵌合体[10]、母体染色体异常[11]、胎盘发生病变或异常等情况均可影响NIPT结果的准确性[12]。因此，NIPT结果为阳性者，建议进一步行有创产前诊断检查进行确认，并及时追踪随访。

综上所述，NIPT技术是一种无创、快捷、准确的产前筛查新技术。随着NIPT样本的不断积累和技术的优化，其准确性和局限性将进一步改善，并将成为产前筛查技术未来发展的大趋势，但目前仍有待完善之处，尚不能取代传统的染色体核型分析技术。故在现有技术条件下，尚需不断完善，并与多种产前筛查技术相互配合，才能提高染色体异常性疾病的检出率，达到降低出生缺陷发生率、提高人口素质的目的。

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