单细胞分析研究进展

丁钟欢 综述，卢忠心 审校

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院检验科，武汉 430000)

细胞是组成人体组织与器官的基本单位，通过细胞集合进行的研究通常会错失很多重要信息，主要是由于细胞集合性研究反映的是这一细胞集体的平均水平，而单个细胞间表达的信息往往千差万别。肿瘤细胞的突变状态、表观遗传状况以及相关蛋白的表达水平等重要信息可能只有一小部分甚至少数几个细胞表达[1]。另外，很多能反映疾病状态的珍贵细胞，如母体血胎儿细胞、循环肿瘤细胞(CTC)的数量非常稀少，很容易被大量的背景细胞所干扰[2]。因此，近年来随着个体化医疗的发展及二代测序技术的提高，单细胞分析逐渐受到关注。

单细胞分析即是通过相应的技术对单个靶细胞进行分离提取，并通过全基因组扩增及二代测序等技术对靶细胞内的基因组信息、蛋白信息进行分析的过程。通过单细胞分析，会将肿瘤进展过程中的细胞变化、单个CTC的遗传状态、细胞与细胞间的异质性、利用胎儿细胞遗传疾病等问题迎刃而解[2]。本文将从近年来单个细胞的分离与提取手段、全基因组扩增及下游组学分析等研究进展作一综述。

1　单细胞的分离与提取

单个细胞的分离与提取是进行单细胞分析的前提条件。流式细胞术等传统细胞分离方法对单细胞的分离效果并不理想；近年来，有很多学者对单细胞的分离与提取方法进行了不断地探索。新发展的方法是结合了几种传统方法的特点而建立的新方法。例如，CAMPTON等[3]于2015年报道的单个CTC的分离检测系统-AccuCyte®-CyteFinder®系统将离心、染色、镜检、细胞挑选集于一体，大大提高了单细胞分离的效率。

另外，传统方法的改进与发展也是近年来研究的热点，很多方法是基于微流控芯片检测方法的改进。如ZHANG等[4]利用油性小滴将细胞隔离为单个细胞，再与微流控芯片系统结合进行检测，其单细胞的分离效率超过90%。ANTFOLK等[5]将分离CTC的声动力分选富集芯片与介电电泳芯片结合成联合式的微流控系统可用于单个CTC的检测。还有ZHANG等[6]报道的“3D凝胶岛”芯片芯片，ANTFOLK等[5]报道的不同组分结构芯片，以及KIM等[7]报道的单细胞检测芯片等都表明其对单细胞具有较好的分离效果。另外，也有免疫磁珠法的改进，如HUANG等[8]报道表明用微磁珠与微流控芯片结合的新方法能提高对CTC的捕获效率，在癌细胞模型中的捕获效率超过97%。也有人工细胞提取技术的改进，如YOSHINO等[9]首先将乙二醇二丙烯酸酯光聚合水凝胶与微阵列捕获进行结合对单细胞进行分离和下游分析。KRONEIS等[10]报道的自动激光微分离法能准确地分离特异性染色的单个靶细胞。此外，也有利用靶细胞的新特性或利用新技术进行单细胞分离的新方法，如DENG等[11]发现在封闭的小室内用激光诱导前向转移技术也能很好地对单个细胞进行分离。 CHEN等[12]利用微量吸管液体乳胶生成器生成很多乳糜状的油性小滴，能将单个细胞包被在此环境中进行全基因组扩增和下游分析。

总的来说，这些研究均表明，可根据靶细胞的不同特性进行多种不同方法的单细胞分离，但是这些分离方法仍局限于实验室探索阶段，高效、特异、简单的单细胞分离方法有待进一步的验证。

2　单细胞信息分析

2.1全基因组扩增单细胞基因组DNA水平低至6 pg，每个基因只含有2个拷贝数，因此，利用普通方法进行单细胞基因组扩增与分析是不可行的[2]。目前为止，传统的全基因组扩增方法主要包括点聚合酶链反应(DOP-PCR)、多重置换扩增法(MDA)、多重退火及环式循环扩增法[2]。由于基因组覆盖的广度不同、鸟嘌呤与胞嘧啶碱基水平差异产生扩增偏倚、等位基因缺失、等位基因优先扩增等因素会使这些全基因组扩增方法间存在明显的差异，能影响下游的微阵列芯片及二代测序分析。

因此，近年来人们也在对全基因组扩增方法进行不断的改进与探索。最近，CHEN等[13]的转座子插入线性扩增法通过转座子插入进行线性放大，DNA被含有T7启动子的Tn5转座子随机片段化，T7启动子允许线性扩增，该方法能在千碱基分辨率进行微拷贝数变异(CNA)、单核苷酸变异(SNV)的检测。 PICHER等[14]报道了一种特殊的DNA聚合酶-TthPrimPol酶，具有比Phi29 DNA酶具有更强的聚合活性，利用该酶进行的多重置换扩增反应比Phi29具有更广的基因组覆盖度及单核苷酸变异位点检测能力。 LEUNG等[15]通过一种油性-MDA，能在纳米级体积的基础上进行高效的单细胞全基因组扩增。

总之，随着单细胞，特别是CTC、循环胎儿细胞等珍贵细胞在临床中扮演着越来越重要的角色，单细胞全基因组扩增技术逐渐受到重视，为下游测序及相应基因组分析提供良好的基础。

2.2单细胞基因组测序分析全基因组测序是筛查单细胞SNV及CNA的有效手段，是检测拷贝数变异的有效工具。目前为止，大规模平行测序技术主要在2个平台上进行检测：Illumina公司的 HiSeq/MiSeq平台以及Thermo Fisher Scientific公司的Ion Torrent测序平台[16]。 HiSeq平台因测序覆盖度更广及价格较为低廉而被更广泛地使用。而Ion Torrent平台则更倾向于靶向测序，是临床上用于突变等检测的金标准。另外，不同类型变异的检测所要求的测序深度不同；如单细胞拷贝数变异分析所要求的测序深度较浅，可低至0.1～2.0 ×，而单细胞单核苷酸变异的测序深度则较大，为30.0～50.0 ×[17]。

值得一提的是，在基因组中，外显子虽然只占其全长的1%，却包含了约85%疾病相关的变异位点，因此，外显子组测序也十分重要。外显子组测序只对外显子进行富集、扩增，所以其相比全基因组测序能更加高效、更利于编码序列的读取。目前，几种可用于单细胞外显子建库的方法包括NimbleGen′s SeqCap、Agilent SureSelect、 Illumina TruSeq 及Nextera Exome[18]。 CHILAMAKURI等[18]对这4种方法进行评估结果显示，Illumina平台能更高效地对编码及翻译区域的碱基进行读取。此外，Nextera Exome技术结合了样本准备的简化程序及TruSeq的富集程序，使DNA需要量更少、时间需求更短[19]。

2.3单细胞转录组分析在单细胞中，mRNA虽然水平较低，但也存在着上千个拷贝数，这使单细胞转录组分析成为可能[2]。而mRNA需经过反转录为cDNA后经PCR扩增后才能进行测序分析，因此，高效、无偏差地反转录是扩增、测序的先决条件。细胞外转录本线性 RNA扩增法是最早被用于扩增转录组RNA的方法，促进了单细胞转录组分析的发展[20]。目前，主要有以下几种改良的cDNA扩增法：全组PCR扩增法、3′末端扩增法及链开关介导的反转录扩增[21]。另外，几种新的RNA测序方法也在探索与发展中，其中包括：细胞内转录本分析、单分子荧光原位杂交及荧光原位杂交RNA测序等[2]。

2.4单细胞蛋白质分析单细胞蛋白质分析对了解细胞信号通路及细胞间的异质性具有重要的作用。传统的蛋白检测方法例如凝胶电泳法、免疫测定法、层析法、质谱法都需要大量的细胞作为标本。因此，单细胞蛋白质分析的主要瓶颈在于单细胞内及其只有少量的蛋白质而缺乏有效的扩增方法[22]。最近，一些方法学的发展也能使单细胞蛋白质分析具有较好的灵敏度与特异度[2]。如LINDSTROM等[22]报道的以微流控芯片为基础，发展的小型流式细胞仪能对少量细胞(100～1 000)进行分析。MELLORS等[23]的研究表明，通过加入毛细管电泳改进质谱的方法使其灵敏度提升，能同时对单细胞中多达40项参数进行测量。 DENG等[24]报道显示，的通过多聚赖氨酸标签结合微流控芯片的方法能有效对单个CTC细胞蛋白质水平进行评估。即便如此，单细胞蛋白质分析仅仅是一个开端，更简便、更灵敏的单细胞蛋白质检测方法与手段有待进一步的探索和研究。

3　小　　结

目前，单细胞的分离与提取方法仍未成熟，近年来探究的方法常以各种传统方法相结合、传统方法的改进以及利用新特性等方式为主；全基因组扩增的发展为单细胞基因组及转录组序列分析奠定了良好的基础；单细胞蛋白质表达分析为细胞间通路及其相互作用提供了条件；完善单细胞分离、提取手段及信息分析方法对研究细胞间异质性及稀有细胞用于疾病诊断等方面具有重要的意义。

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