自噬在高血糖致动脉粥样硬化的研究进展

柯世业 石光耀 综述 钱孝贤 审校

(中山大学附属第三医院心血管内科，广东 广州 510000)

糖尿病是以持续性高血糖症为特征的慢性代谢性疾病，它在发展过程中出现多种严重危害机体的慢性并发症，尤其是糖尿病血管病变。综合统计发现中国糖尿病发病率为9.9%，而65～74岁年龄组更是达到14.1%[1]；糖尿病患者冠状动脉粥样硬化的发病率及病死率是非糖尿病患者的2.40倍[2]。由于高血糖致动脉粥样硬化发病率高、危害大，现早已被认为常见和严重的糖尿病慢性并发症之一，并成为当今的研究热点。在高血糖致动脉粥样硬化病变过程中，自噬在高血糖致动脉粥样硬化的发生、发展中扮演着重要角色。目前，自噬作为高血糖致动脉粥样硬化重要的潜在治疗靶点受到越来越多的关注。

1 自噬的概述

1.1 自噬的概念与分类

自噬是一种通过回收内源性物质为细胞提供营养和能量的应激应答机制。细胞自噬通过降解细胞内衰老、损坏的蛋白质或细胞器，为处于饥饿或代谢压力状态下的细胞提供能量，使得细胞在应激状态下能够维持内环境稳定和存活[3]。而在病理状态下，过度自噬或自噬缺陷可导致细胞的功能障碍和死亡。目前，根据底物进入溶酶体途径的不同，可分为巨自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬[4]。巨自噬是指内质网来源的双层膜结构包裹胞内物质形成自噬小体，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体降解底物的过程。受饥饿等刺激时，细胞还可发生微自噬，即溶酶体膜直接包裹胞内物质。分子伴侣介导的自噬不形成膜性结构，具有特殊基质的蛋白质被热休克蛋白70识别后，再与溶酶体膜上特殊受体结合，从而进入溶酶体内的降解，仅存在哺乳动物细胞中。目前关于巨自噬的研究最多，现在讨论的自噬指的也是巨自噬。

1.2 自噬的调节信号通路

自噬的发生与饥饿、缺血缺氧、氧化应激、DNA受损等有关[5]；其信号转导通路受许多诱导因素及调控基因的影响。自噬的信号调控十分复杂，目前较肯定的是雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和Beclin-1等途径。

1.2.1 mTOR信号通路

mTOR存在mTORC1和mTORC2两种形式，两者对雷帕霉素的敏感性不同。mTORC1通过调节转录、翻译以及自噬调控细胞的生长，它可被雷帕霉素磷酸化后抑制；而mTORC2不被雷帕霉素所抑制，它通过调节细胞骨架来调控细胞的生长。mTORC1负向调节自噬，在营养充足的情况下，它通过磷酸化UNC-51样激酶(ULK1)抑制ULK1复合物的活性，并阻止ULK1同磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)的结合，进一步减弱ULK1复合物的活性，抑制自噬[6]。而当mTORC1被饥饿或雷帕霉素等抑制时，可致mTORC1与ULK1解离，解离后的ULK1发生去磷酸化，ULK1复合物被激活，启动自噬[7]。由此可见，mTOR可负向调节自噬的发生，是调节自噬的重要环节。

1.2.2 Beclin-1信号通路

Beclin-1是哺乳动物参与自噬的特异性蛋白，其通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(ClassⅢPI3K)Vps34形成复合物后在自噬前体中定位，被活化的ULK1复合物通过Ambra1激活，来调节其下游自噬相关基因(autophagy associated gene,ATG)编码蛋白，从而调节自噬活性[8]。除此之外，在无mTORC1参与的情况下，AKT和EGFR可通过磷酸化Beclin-1调节自噬[9]。可见，Beclin-1是自噬的另一重要调节通路。

1.2.3 AMPK的调节作用

AMPK可调节细胞生长、自噬与凋亡等多种细胞活动，其作为mTOR上游区域的活化区，激活后可通过磷酸化Tsc2，活化Tsc1/Tsc2的肿瘤抑制基因蛋白，进而促进mTORC1的失活，诱导细胞自噬[5]。AMPK也可以直接磷酸化ULK1和Beclin-1进而引起自噬[10]。mTORC1、Beclin-1、AMPK以及MAPK、SIRT1-FOXO1、CaMKK- α等其他信号通路之间相互作用，构成了一个相互联系的网络，紧密地调节自噬。

1.3 自噬的分子标志与抑制剂

细胞内受损的蛋白和细胞器泛素化后被识别，并通过p62和LC3连接进而被自噬清除。p62和LC3的水平反映了自噬的状态：在自噬的启始阶段，p62作为自噬受体与泛素化的蛋白质结合，与自噬活动负性相关；LC3-Ⅰ被脂化修饰形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ识别受损物质并促进形成自噬小体并在最后被溶酶体水解，这使LC3-Ⅱ可以作为可靠的自噬标志蛋白[11]；自噬小体和溶酶体融合生成自噬溶酶体，这个过程由SNARE蛋白如Rab7和Lamp2a等调控。自噬溶酶体内的物质被组织蛋白酶分解，p62伴随受损物质被分解，而LC3-Ⅱ可能被降解或者被回收至胞液。因此，自噬正常激活时，LC3积累量升高，LC3-Ⅰ转化成LC3-Ⅱ，而p62降低反映了自噬溶酶体内物质的正常降解；在自噬初始阶段障碍时，LC3-Ⅱ、Beclin-1量降低，p62量升高，但在自噬终末阶段障碍时，LC3-Ⅱ量正常甚至升高，p62量也升高。

目前3-甲基腺嘌呤和巴佛洛霉素A1(bafilomycin-A1,BAF)是研究自噬的常用抑制剂，3-甲基腺嘌呤通过抑制Beclin-1通路阻断自噬小体形成；而BAF可抑制溶酶体功能，在自噬终末期阻断自噬小体和溶酶体融合，降低自噬液泡的降解。

2 自噬在高血糖致动脉粥样硬化的细胞机制

目前动脉粥样硬化的病理过程尚未明确，其中“内皮损伤反应学说”最为广泛认可。该学说认为动脉粥样硬化的形成是动脉对内膜损伤作出一系列炎症纤维增生性反应的结果：高血糖等危险因素可导致内皮细胞损伤；单核细胞黏附损伤的内皮细胞后移入内膜下成为巨噬细胞，并随后转变为泡沫细胞；在某些生长因子等作用下，平滑肌细胞可从中膜迁移至内膜并发生显著增殖，亦可转变成泡沫细胞。由此看来，糖尿病患者内皮细胞功能障碍和血管壁的改变所形成的动脉粥样硬化斑块是导致动脉粥样硬化的基础。

2.1 高血糖对自噬的影响

当机体处于低血糖状态时，细胞内ATP水平降低，AMP/ATP比值升高，AMPK被激活后引起自噬从而维持内环境稳定和存活[12]。而高血糖状态可使细胞AMPK活性降低和ULK1磷酸化，导致自噬水平下降，并致细胞内氧化物产生增多，激活了炎症前期的相关信号通路，造成胞内蛋白质和细胞器的损伤，受损蛋白和细胞器无法通过自噬清除，从而引起细胞凋亡和炎症发生[13]。可见正常水平的自噬对维持心血管系统生物功能正常是必须的；而在高血糖状态下，自噬缺陷可促进细胞的功能紊乱，会导致心血管系统严重的功能失调。但有趣的是，有研究证实高血糖症可导致细胞内活性氧化物含量升高，使蛋白质和细胞器损伤，最终导致细胞凋亡，而AMPK在细胞凋亡前期被激活上调，AMPK通过激活ULK1和抑制mTORC1，使细胞自噬过度激活，导致细胞功能障碍[14]。此外，也有研究表明ERK通道作为MAPK家族成员之一，其可被糖尿病患者过量的糖和蛋白质合成的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)激活后加速GTP水解的比例而诱导自噬[15]，自噬在高血糖致动脉粥样硬化病变进程中的作用机制亟需进一步明确。

2.2 自噬与高血糖致内皮细胞功能紊乱

内皮细胞功能紊乱是高血糖致动脉粥样硬化的始动因素，此时可观察到内皮细胞自噬的受损[16]。自噬受损会使清除高血糖状态下活性氧化物诱导损坏的蛋白和细胞器的能力受限，最终导致内皮功能紊乱。用高糖处理内皮细胞正常对照组与营养素缺乏对照组，两者mTORC1的活性均升高，细胞自噬受抑[16]。而利用雷帕霉素抑制mTORC1活性而激活自噬，可抑制炎症发生，保护内皮细胞功能[17]，证实了高血糖诱导内皮细胞自噬缺陷在动脉粥样硬化进展中的重要性，但其具体机制仍有待进一步明确。Fan等[16]分别使用Tcs2 siRNA和raptor siRNA上调及下调高糖状态下内皮细胞mTORC1表达，发现mTORC1被上调时细胞LC3水平升高，p62水平降低；而受损自噬的恢复可促进氧化活性物质及受损蛋白质、细胞器得以清除，使细胞生存活力得以改善及恢复，表明了高糖抑制自噬发生于初始期。而Fetterman等[18]用高糖培养人动脉内皮细胞模型，模仿2型糖尿病患者的内皮细胞，发现与对照组相比，高糖组p62表达升高，但LC3的总水平不存在区别，表明高糖抑制自噬是发生于自噬溶酶体形成阶段，而Beclin-1不存在区别更进一步说明并非发生于自噬初始阶段，Rab7a和Lamp2a水平相应升高则可能是细胞调节自噬的补偿性变化。这些变化与用BAF处理对照组细胞60 min后自噬标志蛋白的变化是一致的。Zhang等[19]发现高糖可升高LC3-Ⅱ的积累，而再用BAF去处理，LC3-Ⅱ的积累不会进一步升高，也表明了高糖抑制自噬是发生于自噬溶酶体形成阶段，抑制自噬液泡的降解。

改善及增强内皮细胞被高糖抑制的自噬功能，是改善内皮功能的潜在治疗方法。多项研究表明，mTORC1抑制剂如雷帕霉素可激活自噬改善内皮细胞功能[17]。而白藜芦醇的甲基化衍生物TMS可通过上调TRPC4的表达间接抑制mTORC1促进自噬[20]，并激活CaMKK-α从而使AMPK α磷酸化[21]。AMPK被激活后可活化Tsc1/Tsc2的肿瘤抑制基因蛋白，促进mTORC1的失活，诱导细胞自噬[5]。使用绿茶多酚和高糖同时处理内皮细胞，LC3-Ⅱ水平较单用高糖处理时下降，同时p62降低、Beclin-1升高；而再使用BAF处理后，LC3-Ⅱ进一步升高，证实绿茶多酚能减轻内皮细胞被高血糖诱导的自噬抑制[19]。此外，也有研究表明亚精胺处理高糖组细胞后，自噬相关蛋白会发生变化，包括Beclin-1升高等[16]。

相反，也有学者认为在高糖状态下蛋白质和细胞器损伤增加，会导致细胞凋亡；AMPK在内皮细胞凋亡前期被激活上调，AMPK通过激活ULK1和抑制mTORC1，使细胞内自噬过度激活，导致细胞功能障碍[14]。自噬标志蛋白表现为LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、ATG7和Lamp2升高，p62降低，而NaHS和AMPK siRNA可通过降低AMPK抑制高糖时过度激活的自噬，从而改善内皮细胞功能[14]。

2.3 自噬与巨噬细胞凋亡

在动脉粥样硬化损伤中，许多巨噬细胞转变成富含胆固醇脂的泡沫细胞，最终经历凋亡和坏死并征募更多的巨噬细胞；若泡沫细胞不能被M2巨噬细胞有效清除，会经历第二次坏死并形成坏死中心。而在动脉粥样硬化晚期，伴随着巨噬细胞吞噬清除作用的缺陷，巨噬细胞发生凋亡并促进斑块破裂，导致急性动脉粥样硬化血栓形成[22]。巨噬细胞自噬缺陷可增加泡沫细胞的形成与炎症因子的产生，促进动脉粥样硬化进程[23]，但目前关于高糖状态下动脉粥样硬化进程中的巨噬细胞自噬改变及其凋亡机制的相关研究比较有限。

7-酮基胆固醇(7KC)可促进巨噬细胞氧化应激、内质网应激及凋亡，巨噬细胞通过7KC处理后的点状荧光图案，提示细胞内有大量的双层膜结构的自噬小体[24]。使用7KC能增加BAF存在与否时LC3-Ⅱ的差值。而当ATG5缺陷时，加强了晚期的受损巨噬细胞氧化应激和凋亡，促进斑块破裂；即使用7KC处理，双层膜结构的荧光染色还是减少[25]。此外，ATG16L1为自噬小体形成所需的蛋白，ATG16L1缺陷或ATG5缺陷的巨噬细胞可升高白介素-1 α和白介素-18水平，上调Toll样受体表达，意味着细胞炎性体被激活。这表明7KC等动脉粥样硬化相关刺激因子能诱发巨噬细胞自噬拮抗凋亡；而自噬抑制如ATG5缺陷或沉默Beclin-1会增加巨噬细胞的凋亡[26]，但高糖状态下巨噬细胞自噬的改变并未清楚。生理状态下机体对细胞死亡作出反应时，自噬通常是很迅速和有效的，并能进而阻止后续凋亡坏死和炎症[3]。但是事实上自噬在动脉粥样硬化晚期通常缺陷，其中的机制仍未明确。

在泡沫细胞及非泡沫细胞，ATG5缺陷都会明显增加KOdiA-PC/毒胡萝卜素诱导的细胞凋亡。巨噬细胞暴露在凋亡前诱导因子最终死亡，提示细胞死亡原因不是凋亡前进程的长期作用压制了自噬的保护作用，就是自噬应答最终减少[27]。泡沫细胞自噬减少已被证实，用雷帕霉素激活自噬可减少脂质聚集和泡沫细胞形成，这说明自噬失调可能是动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的决定因素之一[28]。

2.4 自噬与平滑肌细胞

平滑肌细胞在动脉粥样硬化病理进程中起促进作用，正常情况下，平滑肌细胞产生胶原形成纤维网，可防止斑块成熟及血栓形成；然而，活化的内皮细胞及巨噬细胞释放的前炎症因子可促进平滑肌细胞增殖及表型改变，导致斑块进展。

2.4.1 自噬与平滑肌细胞增殖

用AGEs处理6 h后的平滑肌细胞，其LC3-Ⅱ表达水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高，并且其电镜下自噬小体较用BSA培养的平滑肌细胞多，表明AGEs可诱导平滑肌细胞自噬；平滑肌细胞在100 μg/mL AGEs处理48 h后增殖增加，而事先用3-甲基腺嘌呤处理的平滑肌细胞，AGEs促进增殖的效果则被减弱[29]。通过先加入ERK抑制剂或Akt激活剂，再用AGEs处理股动脉平滑肌细胞，证实AGEs是通过激活ERK和抑制Akt信号通路诱导平滑肌细胞自噬；此外，用RAGE siRNA干扰RAGE可降低自噬，表明RAGEs在AGE诱导自噬中起关键作用，AGEs与RAGE结合，在平滑肌细胞增殖中亦起关键作用，并加速高血糖致动脉粥样硬化的进展[29]。因而可以推断，高血糖致动脉粥样硬化过程中AGEs诱导的平滑肌细胞增殖，是AGEs诱导自噬的结果,高血糖通过影响自噬参与平滑肌细胞增殖的机制有待深入探究。

2.4.2 自噬与平滑肌细胞表型转化

平滑肌细胞具有显著可塑性，在动脉粥样硬化病理过程中，平滑肌细胞可转变成泡沫细胞[30]。证据表明，各种刺激在诱发血管疾病过程中可以调节自噬活动，并调制平滑肌细胞表型和生存能力。血管平滑肌细胞中的自噬是由饥饿(特别是缺乏氨基酸)、缺氧、活性物种、药物、生长因子和细胞因子等多种因素和信号通路激活的，不同的因素对自噬产生不同的表现形式：血管损伤后细胞分泌的血管源性生长因子(PDGF)可通过脂质亲电体清除收缩蛋白和受损蛋白从而激活有细胞保护作用的自噬，而PDGF又能促进平滑肌细胞表型转化，表明在平滑肌细胞表型中起重要调节作用的生长因子，也能调制自噬的活性[30]。但PDGF激活自噬的具体机制仍有待进一步确认，尤其是高血糖状态下能否通过PDGF激活自噬尚不得而知。而在某些情况下，一些细胞因子和分泌因子如骨调素和肿瘤坏死因子-α则可以引出致细胞死亡的病态自噬；此外,替米沙坦和阿托伐他汀等药物诱导的自噬形式有效地降低脂滴积累和钙化。这些形式的自噬似乎对平滑肌细胞表型转变起关键作用，抑制自噬将阻止表型变化[31]。

目前关于自噬在平滑肌细胞转型成泡沫细胞过程中的作用研究不多。胆固醇负载培养平滑肌细胞并用氧化型低密度脂蛋白处理，不仅能诱发自噬，也能导致巨噬细胞复合标志物的表达，这提示这两个过程间存在联系[32]，而具体明确的联系仍有待进一步研究。

综上所述，正常的自噬在受损蛋白和细胞器的清除中发挥了重要作用，促进血管细胞存活。自噬受损或自噬过度，可能导致细胞死亡，这一过程具有潜在的临床意义。目前认为自噬在糖尿病及高血糖致动脉粥样硬化的病理过程中发挥着重要作用，但其具体作用机制仍不十分清楚，还需更进一步探讨。在未来的研究中，自噬将成为研究热点，如何适时调控和干预自噬信号通路，从而发挥自噬对高血糖致动脉粥样硬化的保护作用越来越被重视，这将会为临床治疗高血糖致动脉粥样硬化等糖尿病血管并发症提供更多的理论依据。

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