一株昆虫病原真菌的分离与鉴定

黄 姗 寇山林 刘加顺 彭丽敏

（潍坊护理职业学院，山东青州 262500）

农作物病虫害是制约我国生态农业发展的重要因素。化学农药的兴起对防治病虫害起到了非常重要的作用，但是化学农药具有易残留和易污染环境等特点，因此，利用生物治剂防治农业害虫越来越受重视[1]。昆虫病原真菌是重要的生物防治来源，国内外利用虫生真菌防治蝗虫、蛴螬等农业害虫已取得阶段性进展，但对能引起自然流行病的病原菌株研究相对较少[2-4]。本研究收集田间感染流行病的鳞翅目僵虫，对其病原菌株进行分离纯化，观察菌株的生长状况和培养特征，同时对菌株ITS序列进行扩增和分析，最后确定该流行病菌株的分类地位。

1 材料

1.1 僵虫 僵虫标本采集自山东省临沂市农家田地，经鉴定该批受真菌侵染死亡的昆虫多数为鳞翅目幼虫。

1.2 供试培养基 萨氏麦芽糖琼脂培养基（SMAY）和1/4SDAY培养基均参照文献[1]的方法配制。

1.3 主要试剂 PCR扩增试剂购自天根生化科技（北京）有限公司，真菌核糖体转录间隔区基因ITS引物通过Primer5.0软件设计，由生物工程(上海)有限公司合成。

2 试验方法

2.1 菌株分离纯化 2016年6月，从临沂市沂水县的农家田地发现大量昆虫僵虫，收集部分僵虫至实验室，用无菌水冲洗僵虫表面的分生孢子，制成分生孢子悬浮液，制作临时装片，在显微镜下观察，发现所有僵虫体表的分生孢子形态大小一致，从僵虫中随机抽取1例进行病原真菌的分离培养。具体方法是用接种针蘸取虫体表面的分生孢子划线接种到1/4SDAY培养平板上，将平板置于25 ℃的培养箱中培养，待孢子萌发长出菌落后，将形态不同的菌落挑到新的平板上进一步接种纯化，直至获得菌株纯培养。

2.2 菌株的形态学鉴定 将分离到的病原菌接种到SMAY产孢培养基上，观察菌落特征，插片培养菌株，待其开始产孢时，将玻片取出制作临时装片于显微镜下观察，记录菌株菌丝、分生孢子梗及分生孢子的显微形态，根据菌株菌落特征、孢子梗形态及孢子发生方式进行形态鉴定。

2.3 菌株的分子生物学鉴定 在SMAY平板上培养菌株，待大量产孢后，刮取分生孢子至研钵中，加液氮研磨以提取基因组DNA，提取方法按DNA提取试剂盒说明进行，Primer5.0设计引物，PCR扩增ITS序列，并将扩增产物送至华大基因进行双向测序，测序结果在GenBank数据库进行Blast比对，确定与其亲缘关系近的菌株。

3 结果与分析

3.1 菌株的菌落形态特征 将菌株的分生孢子接到新的SMAY培养基上，3 d后即见白色绒毛状菌落，随着培养时间的增长，菌落不断扩大并逐渐变干燥，菌落背面呈红褐色，易皱裂。培养10 d左右，在菌落中部开始呈现绿色的分生孢子，并逐渐朝内外蔓延，最终整个菌落被分生孢子覆盖，呈橄榄绿色。

3.2 菌株显微形态特征 插片培养法培养菌株，制作临时装片，观察菌株菌丝、孢子梗及孢子形态，在光学显微镜下，Mr01的分生孢子近似椭圆形状，呈淡绿色，有些孢子连接在一起。此显微形态与报道的莱氏绿僵菌分生孢子相同。

3.3 菌株分子生物学鉴定结果 将Mr01菌株的ITS序列在GenBank数据库中进行Blast比对，发现与其相似性较高的菌株均为莱氏绿僵菌，因此确定该菌株为莱氏绿僵菌。

4 讨论

昆虫病原真菌是进行害虫生物防治的重要资源，而能引起昆虫流行病的菌株尤为受重视。本研究从批量染病的僵虫尸体上分离纯化到一株病原菌，从其形态上初步确定其为莱氏绿僵菌。为更准确地确定其分类地位，本研究对ITS序列进行了扩增，并在GenBank数据库中进行比对，发现与菌株亲缘关系最近的是莱氏绿僵菌，因此，确定此种引起田间昆虫流行病的菌株为莱氏绿僵菌。下一步还需对该菌的生长特性、产孢机理及流行病学等方面进行研究，以研制出高效生物农药应用剂型。

[1]于海勇.斜纹夜蛾幼虫表皮对莱氏野村菌侵染的防御功能研究[D].重庆：重庆大学，2011.

[2]孔琼，袁盛勇，吴志刚，等.营养物质对莱氏野村菌MZ060806生长的影响[J].西南农业学报，2010（5）：1544-1547.

[3]马维思，徐常青，张金良，等.金银花尺蠖及棉铃虫的一种病原真菌鉴定[J].中药农业，2015（9）：934-937.

[4]吕思行，郑常格，江敏华，等.一株昆虫病原性真菌莱氏野村菌的分离与鉴定[J].广东农业科学，2015（15）：53-56.