非转基因抗除草剂作物的获得方法研究

张 杰 卢百亨

（1.宁波市海曙区集士港镇农技站，浙江 宁波 315171；2.宁波市鄞州区姜山镇人民政府，浙江 宁波 315191）

自美国孟山都公司于1995年推出第1个抗草甘膦（农达）玉米品种以来，抗除草剂作物的研发及推广突飞猛进。目前，转基因抗除草剂玉米、大豆、棉花等作物在美国、巴西、阿根廷等国家的占有率已达100%。在转基因作物带来巨大的商业利益和社会效益的同时，其发展受到诸多因素的限制，如高昂的监管批准费用和国际贸易因素。相反，通过人工诱变（化学诱变或辐射诱变）突变除草剂靶标基因产生的抗除草剂作物，由于不含转基因成分，更容易被大众接受，推广面临的政府审批程序也相对简单。

除草剂通过干扰和抑制植物的代谢过程而造成杂草死亡。根据作用机制的不同，除草剂主要分为以下5种：生长调节剂、光和色素及相关组分的合成和代谢抑制剂、氨的代谢及氨基酸的生物合成抑制剂、脂类生物合成抑制剂以及光合电子传递系统抑制剂［1］。根据除草剂的作用机理，科学家针对除草剂靶标设计、开发了大量的低剂量、高活性除草剂。其中，乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂和乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂是低用量、高效、低毒的两类代表性除草剂，其靶标蛋白编码基因的特定位点突变后会增加植物对相应除草剂的抗性。目前市场的非转基因作物均为耐ALS抑制剂或耐ACCase抑制剂作物。非转基因抗除草剂作物的获得主要有人工诱变和基因编辑2种方法。

1 人工诱变

单核苷酸点突变是作物许多重要农艺性状发生变异的遗传基础。单碱基的变异会导致氨基酸替换或蛋白质翻译终止，使基因功能发生改变，从而有可能产生优良的等位基因与优异性状。

1.1 乙酰乳酸合成酶

ALS以高度专一性和极高的催化效率催化两分子的丙酮酸生成α-乙酰乳酸，进一步合成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸。ALS抑制剂通过抑制乙酰乳酸合成酶的活性，阻断支链氨基酸的生物合成，进一步影响蛋白质的合成，致使植物最终逐渐死亡［2］。现已开发出的ALS抑制剂类除草剂共有约13类50余种，其中最具代表性的是咪唑啉酮类（Imidazolinones，IMs）和磺酰脲类（Sulfonylureas，SUs）。ALS 蛋白在 Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Trp 537、Trp 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654和Val 669等氨基酸位点（以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算）发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物（包括玉米、小麦、水稻、油菜和向日葵等）、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。而且不同位点的氨基酸残基变异产生不同类型的ALS抑制剂类除草剂抗性。

巴斯夫公司通过自然选择或化学诱变已培育了多种抗咪唑啉酮类除草剂作物，并将这些作物市场销售的商标命名为Clearfield。目前，在Clearfield体系下销售的作物包括油菜、玉米、水稻、向日葵和小麦等。2017年7月，江苏省农业科学院张保龙团队的“抗除草剂水稻ALS突变型基因专利技术”成果转化1 518万，该成果含多个水稻ALS突变型基因专利以及对应的非转基因抗咪唑啉酮类除草剂两系恢复系、籼稻、粳稻等系列材料，均不含转基因性状，对防治水稻稗草、杂草稻等恶性杂草均具有较好的效果。

1.2 乙酰辅酶A羧化酶

乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A，是植物脂肪酸生物合成的关键限速酶。若丙二酰辅酶A合成停止，植物无法在脂肪酸合成酶的作用下形成脂肪酸，造成膜结构破坏，透性增强，进而导致植物死亡。ACCase是芳氧苯氧基丙酸类（AOPP）除草剂和环己烯酮类（CHD）除草剂的作用靶标酶，这类除草剂对禾本科杂草有优异的防除效果，属于超高效型除草剂，使用范围较广［3］。

许多杂草因为羧基转移酶功能域发生突变而获得ACCase抑制剂抗性，大穗看麦娘（Alopecurus myosuroides）第1 781位由Ile突变为Leu后会获得对除草剂的抗性，黑麦草（Lolium rigidum）、狗尾草（Setaria viridis）、野燕麦（Avena fatua）和黑麦草（Lolium multi fl orum）相同位点突变后也会产生除草剂抗性［4］。ACCase蛋白Ile1 204 Asn、Tyr 2027 Cys、Gly 2096 Ala、Asp 2078 Gly等位点突变后会表现出对芳氧苯氧丙酸酯类除草剂和环己烯酮类除草剂抗性［5］。

第一个报道的抗ACCase抑制剂作物为抗稀禾定（ACCase抑制剂）玉米，Parker等［6］通过组织培养筛选到3个株系B10S、B50S和B100S，这3个株系对稀禾定的抗性增加主要是通过提高ACCase的活性获得的。巴斯夫最近开发了一款耐除草剂水稻系统Provisia™，Provisia除草剂是水稻乙酰辅酶A羧化酶抑制剂。该系统已于2017年获得了美国环保署的登记，允许用于美国2018年种植季。这一系统能够帮助水稻种植者实现更多的轮作管理，允许Clearfield（抗ALS抑制剂）水稻、Provisia水稻以及Roundup Ready（抗草甘膦）大豆或者LibertyLink（抗草铵膦）大豆进行轮作，在不提高杂草抗性的情况下，实现连续的水稻种植［7］。

2 基因编辑

与人工诱变获得抗除草剂作物相比，直接定点编辑除草剂靶基因是作物育种的一个主要目标。基因组编辑技术可以在基因组靶向位点处产生DNA双链断裂（DSB），以人为提供的外源供体DNA为模板，通过同源重组（HR）介导的DNA修复途径来实现对目标基因的单碱基突变。目前科学家已经利用TALLEN和CRISPR/Cas9等因编辑技术成功获得了抗除草剂的玉米和水稻。与人工诱变相比，碱基定点替换技术具有突变效率高、制作简单及成本低等特点，在创造非转基因成分种质资源方面具有广阔的应用前景。

2.1 ALS基因

ALS基因特定位点发生突变后会产生除草剂抗性，目前已有研究者分别通过TALLEN技术和CRISPR/Cas9系统对玉米、水稻的ALS基因进行定点编辑的报道。Svitashev等［8］首先报道通过 CRISPR/Cas9 技术将玉米ALS2基因编码产物第165位氨基酸由Pro变为Ser，突变后的植株表现出氯磺隆抗性。Li等［9］通过TALEN技术实现了水稻ALS基因编码产物第548位氨基酸由Trp突变为Leu、第627位氨基酸由Ser突变为Ile，所得转基因水稻实现了对双草醚的抗性。Sun等［10］通过对CRISPR/Cas9技术也实现了水稻ALS基因这2个氨基酸位点定点替换，获得了抗双草醚除草剂水稻。

2.2 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）

5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）可以催化芳香族氨基酸的合成，是微生物（细菌、真菌）和高等植物中特有的合成氨基酸主要酶。目前生产上推广的抗草甘膦作物，几乎全部为通过导入草甘膦耐受性农杆菌CP4-EPSPS基因获得的。Li等［11］基于CRISPR/Cas9技术，实现了水稻内源OsEPSPS基因保守区2个氨基酸的定点替换（Thr 102 Ile和Pro 106 Ser，TIPS），在T0代获得了TIPS定点替换的杂合体，对草甘膦具有抗性。传代分析结果表明，EPSPS基因的突变可以稳定遗传到下一代。

3 获得抗除草剂作物的其他潜在基因

3.1 原卟啉原氧化酶（PPO）

原卟啉原氧化酶（PPO）催化原卟啉原IX生成原卟啉。PPO抑制剂类除草剂氟丙嘧草酯喷施后可以导致植物快速死亡，而PPO蛋白2个位点（Ser 305 Leu和Tyr 426 Met）发生变异后可以产生对氟丙嘧草酯的抗性。

3.2 α-微管蛋白（α-Tubulin）

Anthony等［12］和Yamamoto等［13］分别报道了牛筋草（Eleusine indica）α-微管蛋白发生Thr 249 Ile突变后会对高水平的二硝基苯胺产生抗性。该位点突变后的牛筋草还可以产生对氨基磷酸盐类除草剂和吡啶类除草剂的交替耐药性［14］。狗尾草中该位点突变后也表现出对二硝基苯胺的抗性，以及对苯甲酸类除草剂的交替耐药性［15］。此外，牛筋草中α-微管蛋白Met 268 Thr和狗尾草Leu 136 Phe突变也可以产生对二硝基苯胺的抗性［16］。

4 展望

目前世界上推广的非转基因抗除草剂作物如Clearfield系列、Provisia系列等全部为人工诱变所得，在美国、拉丁美洲、东南亚等国家和地区取得了重大成功。但传统诱变及单碱基突变筛选技术（如TILLING）需要进行基因组规模的筛选，耗时、耗力，而且鉴定到的点突变数目和种类有限。而基因编辑抗除草剂作物是利用基因工程技术对作物在基因组水平上进行修饰获得的，虽然不含有任何新引入的遗传物质或外源DNA，但是按照我国《农业转基因生物安全管理条例》定义，“农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品。”，仍属于转基因的生物范畴。目前，抗褐变的基因编辑蘑菇和杜邦先锋的基因编辑糯玉米品种已获得了美国农业部转基因监管方面的豁免，基因编辑蘑菇已于2017在美国上市，基因编辑糯玉米最快也将于2021年问世。基因编辑技术可能会被纳入转基因体系监管，但是相信在将来基因编辑获得的非转基因抗除草剂农作物品种定会与常规技术选育的品种一样，不需要面临转基因监管。