液体活检技术及其在前列腺癌诊疗中的应用

肖先金 张绪哲 陈忠 熊承良

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤，随着人们生活方式的改变以及环境污染的加剧，PCa的发病率正在逐年增加。欧美国家PCa的病例数已经超过肺癌和大肠癌，成为危害男性健康第一位的肿瘤[1]。虽然我国PCa的发病率低于西方国家，但随着人均寿命、生活方式和诊断方式的变化，发病率和死亡率都呈明显上升趋势[2]。研究表明，PCa的治疗效果与诊断密切相关，局限性PCa患者5年生存率接近100%，而伴有远处转移的患者5年生存率为33%[3]。因此，开发PCa的早期诊断方法，降低转移及复发率，是当前临床亟待解决的问题。

早期阶段PCa无明显临床症状，早期诊断公认的方法为血清前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)以及直肠B超检查。但PSA的特异性不高，常导致不必要的穿刺活检和过度治疗。目前，PSA检查的意义在广大临床医生中存在较大争议[4-5]。因此，有必要发展新的肿瘤特异性标志物替代或者协助PSA检查，以达到更好的PCa诊断效果。

一、液体活检技术

近年来，以循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和外泌体为检测目标的液体活检技术取得了显著的进展[6]。液体活检具有取样容易、创伤小等特点，可以实现多次、连续检测。ctDNA、CTC和外泌体携带肿瘤相关的基因序列、RNA和蛋白等多维度的信息，可以为癌症的诊断提供丰富的数据，因而具有更高的准确性和特异性。

1.ctDNA及其检测技术：ctDNA是肿瘤细胞脱落或者凋亡破碎后释放进入循环系统的碎片化DNA。 作为特征性的肿瘤标志物，它携带肿瘤细胞的基因突变信息。检测这些特征性基因突变能够为肿瘤早筛、疗效评估和复发监测提供重要的信息[7]。然而，正常细胞在程序性凋亡过程中会释放大量野生型DNA进入循环系统，因而血浆游离DNA(cell free DNA，cfDNA)中，ctDNA所占比例(丰度)很低，相应地，特征性基因突变的丰度也非常低。据文献报道，血浆cfDNA中特征性基因突变的丰度一般在0.001%～10%之间[8-9]，癌症早期丰度会更低。因此，待测样品中突变型DNA周围存在着大量野生型DNA，给突变的检测尤其是癌症早期阶段突变的检测提出了巨大的挑战。

目前，检测ctDNA的常用方法有两大类：测序法和选择性PCR扩增法。测序法可以对未知突变进行检测，提供序列组成、突变类型、突变位置等丰富的信息。第一代测序法(Sanger测序和焦磷酸测序)检测限为5%～10%[10]，远远无法满足ctDNA的检测要求。第二代测序法(next-generation sequencing，NGS)通过增加测序的通量和深度提升了测序的覆盖范围，对获取的大量数据进行分析后，可以得到超长片段甚至整个基因组的序列信息[11-12]。Forshew等[13]利用靶向标记引物选择性扩增目标基因，然后再进行深度测序，提升了NGS的灵敏度，检测限达到2%。 为了进一步提升灵敏度，Newman等[14]开发了深度测序肿瘤个体化建档法(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-NGS)，通过人群大样本分析，筛选出小范围(0.04%)目标基因库，从而可以对目标基因库实现超高深度的测序。CAPP-NGS的灵敏度较高，检测限可达0.02%，并且能够同时检测数百个基因突变，在疾病的机制研究以及致病基因的大规模筛选中有着显著的优势。但是，测序技术的检测成本较高，数据分析复杂，周期冗长。开发更加简便的测序新技术用于微量ctDNA的检测是目前研究的热点之一。

选择性PCR扩增法是在PCR过程中选择性地扩增突变链或者特异性地指示突变链信号的一类方法。用于检测ctDNA的选择性PCR扩增法主要包括：突变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system PCR, ARMS PCR)[15]、定量PCR(quantitative PCR，qPCR)[16-17]、低温PCR(co-amplification at lower temperature PCR, COLD-PCR)[18]以及将上述选择性PCR进行串联组合构建的ARMS-qPCR[19]和ice-COLD-PCR[20]方法。相比测序法，选择性PCR操作简单，检测周期短，但灵敏度不如测序法。ARMS-PCR、qPCR和COLD-PCR检测限为1%；ARMS-qPCR、ice-COLD-PCR等组合型PCR技术的灵敏度有所提升，检测限可达0.05%左右。

新一代的数字PCR技术是在微芯片平台上将血浆循环DNA分散成单分子微乳滴，然后在单拷贝DNA分子上进行PCR扩增，实现了“计数式”的绝对定量。数字PCR的灵敏度很高，检测限可达0.005%～0.05%[7,21-22]，是ctDNA检测技术中灵敏度最高的方法，在热点突变的临床检测中有着广泛的应用。

然而，目前ctDNA检测技术的灵敏度均无法完全满足癌症早期诊断的要求，基于测序和选择性PCR的方法，检测限均为0.01%左右，癌症Ⅰ期的检出率不足50%，对于更早期的肿瘤，检出率会更低，如要进一步提高上述方法的灵敏度，则将显著增加检测的成本并降低方法的鲁棒性。基于测序的检测技术为了达到0.01%量级的灵敏度，测序深度高达10 000×以上，检测成本很高，现阶段难以在临床上大规模应用；进一步提高选择性PCR的灵敏度则需要在体系中继续叠加突变识别单元，导致序列的设计、反应条件的优化更加繁琐，不适合推广应用。为了克服上述缺点，Xiao等[23-27]、Wu等[28]在待测DNA样品预处理以及PCR扩增后的探针检测方面开展了一系列研究。样品处理方面，开发了基于人工序列特异性核酸酶的ctDNA富集技术，可以大幅提升待测样品中突变链(ctDNA)的丰度，为后续检测提供巨大帮助[23]。PCR扩增后的检测方面，构建了一系列基于核酸探针的高灵敏检测体系，包括基于内切酶Ⅳ识别单碱基错配的空位探针循环放大体系[24-26]，基于Lambda外切酶识别单碱基错配的常温探针体系[27-28]以及基于DNA链迁移探针的常温、无酶快速检测体系[27]。这些探针技术可以与开发的样品预处理方法结合起来，构建针对不同检测需求的ctDNA超灵敏分析平台。

2.CTC及其检测技术：随着实体肿瘤的长大，部分肿瘤细胞会发生上皮间质转化，从原发肿瘤上脱落，并通过血液循环系统或者淋巴系统去往身体各处寻找落脚点。其中，经过血液循环的脱落肿瘤细胞称为CTC。外周血中CTC数量极少，平均每105～107个单核细胞中存在1个CTC[29]。因此，CTC的检测包含细胞富集和细胞分析两个步骤。

CTC的富集方法可以分为化学特性富集法(免疫亲和)和物理特性富集法。建立在CTC生化特性的分离富集方法，主要是利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC，或者去除血细胞留下肿瘤细胞。主要包括阳性富集法[30]、阴性富集法[31]和微流体法。①阳性富集法(免疫磁珠吸附CTC)：以CellSearch为代表，在磁珠上包被细胞表面粘附分子(EpCAM)，以捕获CTC。②阴性富集法(免疫磁珠吸附其他细胞)：也称为白细胞去除法，用特异性抗体CD45、CD14等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。该方法较其他富集方法捕获效率更高，但特异性明显低于其他方法。③微流体法：将抗CTC表面特定蛋白标志物EpCAM抗体与磁珠或微流体进行偶联，利用这些固相载体上的抗体直接从血中捕获CTC。物理特性富集法是根据CTC的物理特性，如密度、尺寸以及可变形性等进行富集。包括密度梯度离心[32]、过滤法[33]以及微流控芯片法[34]。①密度梯度离心：根据CTC密度较白细胞、红细胞大的原理，通过离心将它们分开。是一种非常廉价、高效的CTC分离方法。临床实验证明，密度梯度离心富集CTC较CellSearch系统效率更高。②过滤法：依据CTC体积大于血细胞的特性，对CTC进行捕获。CTC的直径约为10～20 μm，而血细胞大小为7～12 μm，通过过滤，留下体积比较大的CTC。③微流控芯片法：针对CTC的体积和可变形性对CTC进行捕获，CTC的捕获率和特异性均可达到80%以上。综合来看，物理特性富集法较生化特性法操作简单、成本低廉，但特异性低，也无法克服CTC在物理特性上的异质性。未来，将两者结合的新型富集技术将是发展的趋势。

通过上述富集方法获得CTC后，需行有效的下游分析。一方面，由于现有富集方法无法保证获得的细胞百分之百都是CTC，因而需要通过下游分析检测技术进一步鉴定确认。另一方面，通过检测和分析CTC表面和内部的癌症标志分子，能够反映肿瘤发生发展的动态变化，为肿瘤的精准诊断和临床分期提供丰富多维的信息。常用的CTC检测技术包括：免疫荧光[35]、PCR[36]、荧光原位杂交(FISH)[35]和二代测序。①免疫荧光法：肿瘤细胞一般为上皮来源，细胞内会表达角蛋白(cytokeratin, CK)或其他肿瘤标志物(如HER2)。通过免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC中的标志蛋白进行识别，从而实现对CTC的检测。该方法检测灵敏度高、速度快，是目前最常用的检测手段。②FISH：根据已知的胞内特异性DNA序列，设计探针与细胞内的基因组中DNA分子杂交，检测该特异基因序列的存在与丰度，从而指示CTC的存在。③PCR：提取CTC中的DNA或RNA，通过逆转录PCR(RT-PCR)对基因的表达进行检测，还可以利用选择性PCR检测DNA突变。④二代测序：CTC数量少，直接进行二代测序难度大，需要将单细胞的DNA扩增后，再利用二代测序读取基因序列信息。虽然单细胞二代测序技术目前尚处于实验室阶段，但它能分析未知突变的序列信息和肿瘤细胞的异质性，不仅能更加准确地鉴定CTC，还能通过对比不同CTC的序列信息，分析肿瘤的发生发展过程，是未来CTC检测的发展趋势。

3.外泌体及其检测技术：外泌体是源于细胞出芽或存储颗粒分泌的细胞外囊泡(cellularvesicles, EVs)样结构家族的总称，其通常伴随细胞激活、坏死和凋亡等过程而产生。EVs由富含脂质的外膜包裹，携带源细胞的部分生物活性物质，如蛋白质、脂质和各类核酸片段等[37]。外泌体在数量上多于CTC，更易富集；在形式上分泌小泡能够有效保护核酸类物质，克服了ctDNA在血液中容易降解的问题，在临床应用上大有可为。与CTC类似，外泌体的检测也包括分离富集和后续检测两个步骤。外泌体的分离富集主要依据物理特性(密度、大小)和生化特性(表面蛋白)来实现，包括差速离心、密度梯度离心、过滤和免疫分离[38]等手段。外泌体的分析根据不同目标物采用不同的分析技术，分析外泌体中的蛋白，可使用Western blot、SDS-PAGE和蛋白组学分析等方法；分析外泌体中的核酸，则可采用PCR、基因芯片和二代测序等。

CTC、ctDNA和外泌体都是液体活检的检测对象，但各有特色。CTC能提高诊疗的精确性，而ctDNA侧重于靶向用药和耐药性指导，外泌体目前还没有成熟的产品，但是外泌体稳定性强，且适用范围广。单独检测CTC的临床意义越来越弱，与ctDNA联合检测，可以充分体现ctDNA的高灵敏度，以及CTC的高特异性和“全息化”的优势。未来，各种方式联合使用将是液体活检的大趋势。

二、PCa液体活检新进展

1.CTC检测与PCa： 近年来，基于CTC的液体活检技术在结直肠癌、乳腺癌、PCa、胃癌等实体肿瘤的检测中得到了广泛的应用。2008年，美国FDA批准了CellSearch平台用于转移性PCa的评估。2016年，中国国家食品药品监督管理总局批准了CellSearch检测系统在结直肠癌、PCa和乳腺癌中的临床应用，开启了液体活检技术在国内临床应用的新篇章。

Nagrath 等[34]对来自上皮细胞肿瘤患者的116份血样进行了CTC-Chip 检测，115 份(99%) 血样中检测到CTCs，其中7例早期PCa患者血样中均检测到CTCs，具有较高的灵敏度和特异度。虽然CTC在早期PCa诊断中的应用还未得到学术界的广泛认可，但在进展和转移性PCa的临床应用中已经取得了巨大的成功。IMMC-38招募了276例转移性PCa患者，对其中231例进行了有效评估。该研究利用CellSearch平台在治疗前后按月对患者的外周血CTC进行持续动态的检测[39]。研究发现CTC 5个/7.5 μl外周血为Cutoff值。该项研究最终使得FDA在2008年批准了CellSearch平台的临床应用。Okegawa 等[40]应用CellSearch 系统对76 例激素难治性PCa患者外周血CTCs进行了检测，探究CTC的数量与患者生存时间的关系。研究发现，CTC数量≥5的患者生存时间(12.0个月)显著低于CTC数量<5的患者(26.0个月)，并且前者的死亡风险明显高于后者。Schwarzenbach 等[41]对81 例PCa患者外周血CTC 进行了检测，发现外周血CTC 与PCa的分期、Gleason 评分存在密切关系。可见CTC 计数可以用来评估PCa患者的身体状况和病情进展。

CTC除了可以用于PCa的诊断，还可实时监测PCa的治疗效果，并根据结果调整治疗方案，实现个体化精准医疗。Scher 等[42]对164 例去势抵抗性PCa(CRPC)患者进行了类似研究，发现大部分患者治疗后CTCs 计数明显下降，且CTCs 计数的变化与生存时间关系密切。Darshan 等[43]研究证实，CRPC 患者外周血CTC 中AR 的亚细胞水平定位与患者对多西他赛化疗的反应密切相关。Antonarakis 等[44]研究发现，在AR-雄激素受体剪接变异体7(V7)阳性的CRPC 患者中，紫杉烷的疗效优于阿比特龙，而AR-V7 阴性的患者中两种药物的疗效相当，推测AR-V7 可用于指导CRPC患者化疗药物的选择。

利用二代测序技术检测PCa CTC中的单核苷酸变化(SNVs)可以提供更丰富的诊断信息，甚至为分子生物学机制研究提供新视野。通过全外显子组测序发现CTCs与原发肿瘤组织具有较高的一致性，对1例PCa患者CTCs的检测发现，73种突变类型有51种出现在配对组织中，一致性达70%。 而肿瘤组织中的56种突变类型有41种在CTCs中检出。

2.ctDNA检测与PCa：目前PCa ctDNA检测的研究热点包括ctDNA的总量、相关基因(致病基因)的点突变和甲基化分析。

大量研究表明ctDNA与肿瘤相关特征具一致性：正常人血浆循环DNA水平很低，而PCa患者循环DNA的浓度明显增高。Goessl等[45]发现，PCa患者中循环DNA的检出率高达100%。Tombal等[46]也发现，PCa患者血液中循环DNA的总量在手术前后、复发前后的变化很大，因此可以作为肿瘤复发的监测手段。

基因启动子区域的高甲基化致使相关基因表达沉默，并进一步影响下游的分子生物学通路，干扰PCa的病理进展和临床预后。与PCa相关的热点甲基化基因包括：癌甲基化蛋白Ⅰ基因、原钙黏附蛋白8基因以及生长阻滞和DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage gene，GADD)等。Reis 等[47]通过检测 34 例PCa患者和 48 例前列腺良性肿瘤患者的血清GADD45a基因甲基化水平发现，PCa组织中的 GADD45a 甲基化的发生率明显高于前列腺良性肿瘤组织。调控microRNA表达基因的甲基化水平也与PCa的发生密切相关，Lin 等[48]研究发现,PCa中 miR-31基因启动子区域DNA高甲基化导致其表达沉默，AR表达升高，有利于PCa的恶性行为发生。大量研究证实 miR-143、miR-218、 miR-375、miR-22、miR-29a 等的高甲基化也参与了PCa形成[49-52]。基因的甲基化异常在PCa早期阶段非常普遍，因此，检测ctDNA的甲基化水平对于PCa的早期诊断有着重要的临床价值。

3.外泌体检测与PCa：EVs是近年来的研究热点，无论在肿瘤，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌等，还是在非肿瘤性疾病，如心血管疾病、肾脏病和自身免疫性疾病等领域中均有大量研究报道。在PCa中，对EVs的研究主要集中在前列腺小体、外泌体。①前列腺小体：当离心速度在～100 000×g时，分离出的PCa相关的EVs称为外泌体或前列腺小体。实际上，前列腺小体就是外泌体[53-54]，为避免混淆，本文对前列腺小体和外泌体分开阐述。PCa患者血浆中的前列腺小体数量通常显著增多，较正常组高3～7倍。因此，前列腺小体的数量可用于辅助诊断恶性肿瘤。前列腺小体中蛋白组学的变化也与PCa密切相关，在PCa PC-3细胞株源性前列腺小体中，可见小窝蛋白Caveolin-1表达[53]，而肿瘤相关蛋白CDCPl和CDl51的表达高于正常人[54]。②外泌体：外泌体中含有的蛋白、miRNA和基因组DNA(gDNA)均携带肿瘤细胞的信息。PCa外泌体的miRNA 谱与源细胞相似，但具有选择性。在分析PCa患者和健康个体血浆MVs(外泌体和微囊泡)的742种miRNAs中发现，有12种在数量上存在差异，其中11种在转移性PCa患者MVs 中的数量明显多于无转移者[55]。Lazaro-Ibanez等[56]在不同PCa细胞株来源的外泌体等EVs中检测肿瘤相关基因MLHl、PTEN和TP53的片段后发现，不同来源EVs所携带的gDNA不同，可包含特异的突变基因。最新研究发现，PCa外泌体携带的NKG2D配体[57]和Fas配体[58]可抑制淋巴细胞毒性功能及增殖，表明调节外泌体的生成和释放，可能是肿瘤细胞免疫逃逸的生理机制之一。

三、总结与展望

液体活检技术通过非侵入式的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，可以实现连续、高频的监测，是“精准医疗”代表性的诊断技术。通过研究血浆中CTC、ctDNA和外泌体的数量、蛋白组学、突变情况以及甲基化水平等多个方面的特征，可以为包括PCa在内的多种恶性肿瘤的诊断和治疗提供“全息化”的信息。但目前液体活检技术仍面临一些亟待解决的问题：中晚期癌症检测技术相对成熟，但价格较高，推广难度大；早期癌症的筛查难度大，技术不成熟。此外，肿瘤异质性大，部分PCa患者很难检测到ctDNA或CTC。未来的发展趋势是发展强大的靶向富集方法，将富集的DNA进行超高深度的测序，在提高检测灵敏度和早期癌症的检出率的同时，大幅降低检测的成本。并且随着检测灵敏度和准确度的提高，部分活检标的含量很低的PCa也可能被检出。此外，对于ctDNA和CTC含量极低的PCa患者，数量更多、包含信息更丰富的外泌体可能是未来的研究热点和突破口。

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