牛体外胚胎生产技术初探

李桂莲，王彦华，张晓霞，张国启，牛 岩，朱伟然，郑爱荣

(河南省饲草饲料站，河南 郑州 450008)

在体外采用人工的方法培养动物的卵母细胞或胚胎，可以获得较多的胚胎量及更为优质的家畜品种。近年来，体外胚胎工程也带来了较为可观的经济效益，这项体外胚胎生产技术对家畜的繁殖以及养牛业的发展也颇为重要。

1 材料与方法

1.1 收集卵母细胞

在发情季节，选取宰杀后肉牛的卵巢，用30℃～35℃含有1%青霉素、链霉素的生理盐水冲洗三遍，然后将其置于装有青霉素、链霉素生理盐水的保温壶中，在1h～3h内运回到实验室。处于发情期的卵巢会有3 mm～6 mm直径的明亮卵泡，采用卵泡穿刺法将卵泡中的卵母细胞抽吸出来，将其置于倒置显微镜下，挑选形态正常，胞质均匀，带有3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用含5% FBS的 TCM-199(Hank’S)清洗三遍。

1.2 卵母细胞体外培养

将IVMD101成熟培养液(TCM-199，5% FBS，1μg/mL雌二醇，0.01 IU/mL 促卵泡素，5 μg/mL黄体生成素，200 mM丙酮酸钠和50 mg/mL 庆大霉素)[1]平衡2h ，将清洗好的COCs以每500μL IVMD101培养液50枚COCs的密度置于38℃，5% CO2培养箱中，培养24 h。取出一部分卵母细胞用0.2%透明质酸酶进行处理，此步是为了更好的去除卵丘细胞，较好的观察牛卵泡破裂和第一极体的排出情况，计算卵母细胞的成熟率。

1.3 体外受精

上浮法[2]处理冷冻精液：从液氮中取出冻存的牛精液，置于35℃水浴锅中复苏，将精液移入约1mL获能液(Tyrode's albumin lactate pyruvate medium, TALP)[3]中，38℃，5% CO2，95% Air 及最大湿度培养箱孵育1h，10000 r/min离心10 min，弃上清，留出约0.2mL 液体，重复两遍，预留的0.2mL 液体中加入0.5mL受精液(TALP、30 mg/mL肝素钠、50 mg/mL庆大霉素和100 IU/mL 青霉素)[4]，将其置于38℃，5% CO2，95% Air 及最大湿度培养箱中悬浮1h ，取上层活力较高的精子，将其密度调整为3×106个/mL准备受精，500 uL受精液50个COCs进行受精，38℃，5% CO2，95% Air 及最大湿度培养箱中受精24h。

1.4 胚胎体外培养

将假定受精后的卵母细胞(卵母细胞周围没有颗粒细胞包围)转移至平衡好的mSOF[5](modified Synthetic Oviduct Fluid, m SOF)培养液(pH 7.2～7.3，107.70 mM氯化钠、7.16 mM氯化钾、1.19 mM磷酸二氢钾、1.71 mM 氯化钙、0.49 mM 氯化镁、25.07 mM 碳酸氢钠、3.30 mM 乳酸钠、0.40 mM 丙酮酸钠、1.46 mg/mL 谷氨酰胺、16 mg/mL 牛血清白蛋白、10μL/mL必需氨基酸、20μL/mL非必需氨基酸、1.3μg/mL酚红、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中[1,5]，洗三遍，并将其置于38℃，5% CO2，95% Air 及最大湿度培养箱中，每48h 更换一半的SOF培养液。每隔24h观察胚胎发育情况，计算各个时期的发育率。选择形态正常，细胞团致密的早期囊胚进行胚胎移植。

1.5 受体母牛的选择与胚胎移植

1.5.1 受体母牛的选择

受体母牛选择标准：身体健康、繁殖性能正常、泌乳性能良好、能自然发情。发情母牛的选择尤为重要，可通过观察公牛爬跨即母牛接受爬跨的程度确认发情，次日再对发情母牛进行直肠检查，确认母牛已排卵，即可作为胚胎移植的受体牛。发情后第7d可将体外培养的胚胎进行移植，移植器插入受体牛阴道，到达子宫颈口时，用移植枪捅破外套填片，插入子宫颈，左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎。移植后大约2个月对母牛进行直肠检查，检查移植母牛是否处于妊娠状态，并计算妊娠率。

2 需要关注的问题

2.1 精子获能

2.1.1 精子获能定义

有学者发现“精子获能”现象是在1951年提出。精子射入雌性动物阴道内时，精子并没有获得使卵子受精的能力，必须在雌性动物生殖道内发生一系列的生理变化，此时的精子才能获得进入到卵子的能力，这一过程称为精子获能。

2.1.2 精子获能原理及生理变化

附睾形成的精子本身已经具备受精的能力，但是由于附睾会分泌一种糖蛋白附着在精子表面，因此掩盖了其受精能力。这种糖蛋白即含有唾液酸的糖蛋白，唾液酸糖蛋白一方面会使精子表面的特异性抗原不被激活，从而逃脱免疫机制的追捕，不发生自免疫反应；一方面还会起到稳定顶体前区的细胞膜作用，抑制精子的顶体反应及受精能力。

精子进入雌性动物生殖道内后，精子顶体表面的去能因子会在生殖道内发生一系列的变化，生殖道分泌物譬如α、β淀粉酶、唾液酸酶等可以分解去能因子，使顶体膜中胆固醇和卵磷脂比率以及膜电位发生变化，顶体膜稳定性降低，从而精子获得受精能力，发生顶体反应，释放顶体酶，在顶体酶的作用下，精子能够穿越放射冠和透明带，进入卵子内部，从而完成受精。

2.1.3 精子获能

精子刚进入阴道时，不会发生获能，穿过子宫颈时，去能因子降解，到达子宫内膜时，产生获能因子，在输卵管完成获能。

2.2 卵子受精

在受精时，卵子进行减数第一次分裂产生一个初级卵母细胞和一个第一极体，初级卵母细胞进行减数第二次分裂产生一个次级卵母细胞和一个第二极体，第一极体分裂产生两个第二极体，但大多数哺乳动物的第一极体不会进行减数第二次分裂。因此，在卵黄膜和透明带的间隙观察到两个极体时，即可判定卵子已经完成了受精，此时的两个极体即是第一极体和初级卵母细胞分裂产生的第二极体。

2.3 同期发情及激素选择

2.3.1 发情周期定义及划分

母牛性成熟后，在神经和激素的作用下，卵巢出现周期性卵泡成熟和排卵。根据发情阶段及生殖道的生理变化可以将母牛的发情周期分为四个阶段：发情前期、发情期、发情后期、发情间期。根据卵巢的机能、形态变化及有无卵泡发育和黄体存在为依据可以将母牛的发情周期分为两个阶段：卵泡期和黄体期。

2.3.2 同期发情的原理

要达到同期发情，通常以两分法为基准。卵泡期即相当于四分法的发情前期和发情期，周期性孕激素水平显著下降，黄体退化，雌激素水平升高，卵泡开始发育，卵泡发育成熟后破裂并进行排卵。黄体期即四分法的发情间期和发情后期，卵泡破裂后形成黄体，黄体分泌的孕激素水平显著升高，抑制了卵泡的发育及成熟，母畜此时未表现发情，从黄体出现至退化，大约维持15d～17d，退化后进入下一个卵泡期。因此要想达到同期发情，就需要控制黄体期的维持时间，使母畜的黄体同时退化，同时进入下一个卵泡期。

2.3.3 同期发情激素选择

2.3.3.1 孕激素

孕激素主要用来延长黄体期。给母牛同时施用一定量的孕激素，抑制卵泡发育，使母牛处于不发情状态，调整母牛黄体期，将母牛调整到同一阶段时，停用孕激素，使母牛达到同期发情。

2.3.3.2 前列腺素及类似物

前列腺素及类似物主要用于缩短黄体期。给母牛施用前列腺素等类似物时，可达到溶解黄体的作用，此时黄体期被中断，时间大大缩短，孕激素水平明显下降，使母牛的卵泡期提前到来，从而调整母牛使其达到同期发情。

2.4 超数排卵及激素的选择

2.4.1 超数排卵及原理

超数排卵是利用外源促排卵激素来诱发卵巢多卵泡发育，并能排出多个具有受精能力的卵母细胞。一般情况下，随着母牛卵泡的发育，99%的有腔卵泡会发生闭锁从而慢慢退化，大约只有1%能发育成熟并排出具有受精能力的卵母细胞，而超数排卵的原理就是在99%的有腔卵泡发生闭锁之前，注射促排卵激素使卵泡不能闭锁从而可以发育成熟，增加具有受精能力的卵母细胞的排出数目，从而使动物能够产多胎，提高优良母畜的繁殖率，加速遗传育种，促进养牛业发展。

2.4.2 激素选择

超数排卵主要选用促性腺激素而不是性激素，因为性激素直接作用于性腺，使用过多会造成性腺萎缩，而垂体释放的促性腺激素作用于性腺，可以达到与性激素相同的效果但不会使性腺萎缩。促性腺激素譬如促卵泡素(FSH)，绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG)等[6]。可根据母牛的体重及超排次数确定使用剂量，一般外源剂量都要远远高于内源剂量。