一种戈谢病突变基因检测方法的建立

郑文彦

（广东华美众源生物科技有限公司，广东佛山528000）

戈谢病（Gaucher Disease，简称GD）又名葡糖脑苷脂酶缺乏症，是溶酶体贮积病中最常见的一种，为常染色体隐性遗传。编码葡糖脑苷脂酶的基因（Glucocerebmsidas，以下简述GBA）突变会造成该酶的缺乏，从而引起葡糖脑苷脂在肝、脾、骨骼和中枢神经系统的单核巨噬细胞内蓄积，导致受累组织器官病变，产生肝脾肿大、骨骼畸形、贫血、生长发育落后、神经系统异常等临床表现［1-5］。

对于戈谢病的临床诊断，酶学及骨髓细胞学的方法最为常用。其中，通过测量外周血白细胞或者皮肤成纤维细胞中葡糖脑苷脂酶的活性的葡萄糖脑苷脂酶活性检测法是“金标准”［6-9］。当外周血白细胞或皮肤成纤维细胞中葡萄糖脑苷脂酶活性降低至正常值的30%以下时，即可确诊戈谢病［10］。但有少数患者虽然具有戈谢病临床表现，其葡萄糖脑苷脂酶活性低于正常值低限却又高于正常值的30%，此时需要进一步的检测以实现确诊。

随着对戈谢病病因学认识的不断加深和研究的深入，基因检测技术已经使戈谢病诊断更加准确，不但可以使戈谢病患者得到确切诊断，还可以诊断基因携带者、追究其遗传学来源［11］。此外，通过对戈谢病患者家族成员进行GBA基因检测，进行遗传咨询，可明确戈谢病发病风险，降低后代戈谢病发病率，减轻患者的经济和社会负担。

戈谢病为常染色体隐性遗传病，目前已发现的GBA基因突变类型达400多种，表型复杂［8，12］。GBA基因的突变类型具有种族差异，在德系犹太人中，N370S（c.1226A>G）、L444P（c.1448T>C）、IVS2+1（c.115+1G>A）以及84GG（c.84dupG）这4种突变占了90%［13］。而中国戈谢病人GBA基因突变分析显示最常见的突变主要是 L444P（c.1448T>C），约占 33%，其次还有 N188S（c.680A>G），F213I（c.754T>A），D409H（c.1342G>C）等，N370S（c.1226A>G）突变在中国戈谢病人中比较罕见［14-15］。

结合上述情况，本研究选取文献记载的4个中国人群突变频率较高的GBA基因位点N188S、F213I、D409H、L444P，建立了一种简单快捷，运用多重荧光片断分析来进行GBA基因检测的方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

扩增目的基因位点的引物及GBA基因片段的人工合成序列由深圳百迈生物公司合成，其他试剂主要包括PCR缓冲液和热启动C-Taq酶购自无锡中德美联生物有限公司。

样本采用Eppendorf 9700 PCR仪进行扩增，产物用3130XL型遗传分析仪（ABI公司，美国）进行电泳检测。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GBA的主要四个高频率基因突变位点，设计了四组荧光引物，每组包括一条带荧光的上游引物和两条识别野生（w）/突变（m）分型的下游引物，引物序列如表1所示。扩增产物排布图如图1所示。

表1 荧光复合扩增引物

图1 扩增产物排布图

1.2.2 聚合酶链式反应

在一个 25 μL 的 PCR 反应体系中含有：DNA 模板 0.5-2.0 ng；混合引物（10 μM）1.0 μL；2X PCR缓冲液 12.5 μL；C-Taq 酶（5 U/μL）1.0 μL；余下用 SdH2O 补足。

PCR反应程序：热启动95℃ 2 min；第一个大循环（10个循环）94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec；第二个大循环（18个循环）94℃ 30 sec，59℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec；终延伸72 ℃10 min；4℃保温。

1.2.3 GBA基因分型

运用ABI3130XL遗传分析仪，进行下列操作：12 μL去离子甲酰胺与0.5 μL分子量内标Marker SIZ-500（无锡中德美联有限公司，中国）混合。再加入1 μLPCR反应产物，涡旋混匀3 500 r/min离心2 min，95℃变性 3 min，-20℃冰孵3 min，后进行毛细管电泳。运用GeneMapperIDX（Applied Biosystems）软件结合产物排布设置对GBA基因分型结果进行分析。

2 结果

2.1 野生型样本分型结果

使用9947A基因组及9948基因组DNA作为模板，按上述方法进行复合扩增及毛细管电泳的结果如图2、3所示。N188S、F213I、D409H、L444P四个基因位点均在野生型（W）位置出峰，表明样本9947A和9948的这四个基因位点均为纯合野生型。

图2 样本9947A分型结果

图3 样本9948分型结果

2.2 突变型样本分型结果

使用人工合成的四个基因座均为突变型的GBA基因片段作为模板，进行复合扩增及毛细管电泳的结果如图4所示。N188S、F213I、D409H、L444P四个基因位点均在突变型（M）位置出峰，表明引物的设计符合预期，可以成功扩增并电泳获得纯合突变型的分型结果。

图4 突变型样本分型结果

2.3 GBA基因分型标准物

按比例调配扩增产物获得的分型标准物制作成标准分型（ladder），做为标准品经毛细管电泳后，结果如图5所示。

图5 GBA基因分型标准物

2.4 实际病例样本分型结果

应用本方法对两例戈谢病患者的血液样本进行检测，毛细管电泳结果如图6、7所示，两例患者的基因分型分别为L444P突变型及N188S突变型。

图6 戈谢病患者1的基因分型结果

图7 戈谢病患者2的基因分型结果

3 讨论

戈谢病是常染色体隐性遗传病，与GBA基因突变有关。常见的突变类型在不同种族之间的差异很大［16］。对于GBA疾病的研究，通常是选取目标人群中突变频率较高的基因位点进行分析。GBA基因突变类型目前已报道有400多种，其中N188S、F213I、D409H、L444P是中国人群突变频率较高的4个GBA 基因位点［14,15］。

本研究从NCBI上获得戈谢病GBA基因的序列，结合文献记载的高突变频率基因位点，设计上下游引物，通过聚合酶链式反应及毛细管电泳，获得GBA基因上述4个位点的基因分型。结果显示，本研究中建立的多重荧光片段分析方法能够快速有效地从基因层面诊断出受检者GBA基因的主要4个位点分型，从而为戈谢病的基因诊断提供参考依据。通过该方法的建立，可为日后开展的产前筛查、遗传咨询等提供便利，也为后期我国各地区开展罕见病的优生优育工作提供支持。

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