豁痰解毒通络饮干预NF—κB/ERK信号通路参与球囊损伤后大鼠颈动脉内膜增生的机制研究

沈娟娟+邓悦+路方平+马金玲+田野+王闻靖+张冰锐

【摘要】目的 研究观察豁痰解毒通络方对颈动脉球囊损伤术后再狭窄大鼠，主动脉平滑肌细胞增生信号通路的调控机制和相关指标。方法 采用SD大鼠建立大鼠颈动脉球囊损伤动物模型；随机分为假手术组、模型组、豁痰解毒通络组、辛伐他汀组、豁痰解毒通络组+辛伐他汀组。采用免疫组化法检测大鼠颈动脉组织ERK、NF-κB蛋白的表达。结果 免疫组化染色结果提示：假手术组无阳性着色。模型组可见较多棕黄色细胞核。豁痰解毒通络组、辛伐他汀组、豁痰解毒通络+辛伐他汀组阳性着色与模型组比较显著改善。结论 豁痰解毒通络饮可以有效抑制大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的增殖，可能通过抑制ERK1/2、NF-κB信号通路来抑制新生内膜的增殖。

【关键词】豁痰解毒通络；PTCA术后再狭窄；血管重构；细胞增殖

【中图分类号】R28 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.32..02

心血管疾病目前已成为威胁人类健康与生命的头号杀手，其发病率和死亡率超过肿瘤性疾病跃居第一[1]。经皮冠状动脉腔内血管成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狭窄（restenosis，RS）是影响冠状动脉粥样硬化性心脏病介入治疗预后的关键问题，严重制约了经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）的远期疗效，成为心血管领域的研究热点和难点[2]。随着对 RS 分子水平机理研究的不断深入，发现许多因素如细胞因子、生长因子等可通过活化细胞外信号调节氨基末端蛋白激酶（JNK）、p38 丝裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路影响细胞周期蛋白及凋亡相关基因，在 VSMC 增殖、分化、凋亡以及转移中发挥重要的调控作用[3-4]。针对PTCA后再狭窄，VSMC 增殖与凋亡调控因素的干预是 RS 防治的切入点。近年来，中医药防治PTCA后再狭窄的研究渐趋活跃。中药具有稳定性好，毒副作用小等特点，己经越来越受到人们关注。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠60只，50日龄，重量（350±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 药品与试剂

中药：豁痰解毒通络饮：双花，当归，甘松，丹参等药物组成。生药由长春中医药大学附属医院药剂科提供，含生药量为2.33 g/mL。辛伐他汀片（远大医药中国有限公司，批号：H20000107，规格：5 mg）。

1.1.3 实验仪器

迷你转印电泳仪（北京鼎国昌盛生物有限公司，DYCZ-24D）；低速水平离心机 （湖南相依离心机仪器有限公司，L-550）。

1.2 实验方法

1.2.1 動物模型制备

大鼠适应性喂养7天。术前背部皮下注射低分子肝素钠注射液，预防急性血栓形成，剂量为500 U/kg。注射1 h后进行造模。腹腔麻醉大鼠。固定大鼠取正中切口，分离并且暂时阻断左颈总动脉、左侧颈外动脉、左侧颈内动脉。结扎小分支。在左颈总动脉近心端采用动脉夹暂时阻断后，于颈内动脉远心端用眼科剪一小切口，在导丝引导下插入3.0×15 mmRunjin球囊导管，迅速插入球囊导管，缓慢伸至颈总动脉近心端处，导管插入深度约4 cm，采用医用球囊扩张压力泵（l～2 atm）充盈球囊，以生理盐水充盈球囊（压力0.6～0.8 atm），持续30 s后，使球囊膨胀至回拉时有较明显的阻力感，保持阻力一致缓慢向远心端旋转回拉，球囊至颈总动脉分叉处，将球囊泄压至0 atm，再次重复以上步骤，反复操作3次。撤出球囊后，迅速结扎左侧颈外动脉，开通颈内动脉和颈总动脉血运循环，分层缝合颈部伤口。术后腹腔注射青霉素抗炎，背部皮下注射低分子肝素钠注射液抗凝3天。假手术组大鼠只分离并结扎左侧颈外动脉，不做球囊拉伤处理。

1.2.2 分组给药

于术后第2天起连续灌胃30天。假手术组、模型组灌胃等量蒸溜水，豁痰解毒通络组灌胃豁痰解毒通络方1.633 g/mL。辛伐他汀组灌胃辛伐他汀0.119 mg/mL。豁痰解毒通络方+辛伐他汀组灌胃豁痰解毒通络方1.633 g/mL及辛伐他汀0.119 mg/mL。每日1次，给药30天。

1.2.3 免疫组化染色法检测大鼠颈动脉ERK、NF-kB的表达

常规脱蜡至水洗，柠檬酸盐热修复，然后室温冷却；清洗；滴加阻断剂，清洗；加封闭液；滴加一抗（ERK抗体效价1：100、NF-κB抗体效价1：100），4℃静置过夜；清洗；滴加生物素标记的抗鼠/兔IgG的第二抗体，清洗；滴加辣根过氧化酶标记的链霉菌抗生物素蛋白，清洗；滴加显色剂，光镜下观察，显色适当用水终止；Mayer苏木素复，蒸馏水冲洗；弱氨水返蓝，蒸馏水冲洗；脱水、透明、中性树胶封片。

1.3 统计学软件

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以百分数（%），例（n）表示，采用x2检验；计量资料以“x±s”表示，采用t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化染色法检测大鼠颈动脉NF-κB的表达

NF-κB通常状况下存在于胞浆，活化后进入核内，免疫组化染色阳性细胞表现为胞核呈棕黄色，并可见棕黄色颗粒沉积。假手术组无阳性着色。球囊损伤术后30天模型组和假手术组可见血管壁新生内膜细胞较多棕黄色细胞核。豁痰解毒通络组、辛伐他汀组、豁痰解毒通络+辛伐他汀组阳性着色与模型组比较显著改善。

2.2 免疫组化染色法检测大鼠颈动脉ERK的表达endprint

p-ERK通常状况下存在于胞质，活化后进入核内，免疫组化染色阳性细胞表现为胞核呈棕黄色，并可见棕黄色颗粒沉积。假手术组无阳性着色。球囊损伤术后 30 天模型组和假手术组可见明显棕黄色细胞核。豁痰解毒通络组、辛伐他汀组、豁痰解毒通络+辛伐他汀组阳性着色与模型组比较显著改善。

3 讨 论

由于球囊反复、持续对血管壁进行刺激，受累血管壁细胞不断激活炎性等刺激因子逐渐形成慢性炎症。由于刺激因子持续存在，在其长期刺激引导下炎性因子表达增高[5]。在其外力持续刺激下血管平滑肌细胞增殖、迁移，致内膜不断增生，进一步血管重塑形成血管再狭窄。

在慢性炎症过程中，损伤的血管平滑肌细胞可释放大量活性物质，这与中医所述病理性津液滞留所致“痰”的理论一致[6]。而慢性炎症过程中血小板黏附、聚集及血栓的产生、纤维斑块及结缔组织的形成、单核细胞转变为泡沫细胞在内皮下的沉积、血液粘稠度增高等现象，又符合中医“瘀”的具体表现[7]。中医认为，“痰”与“瘀”常共同致病，痰瘀互结，蕴结成毒，“毒”损脉络，加重血管的损伤。

我们根据现代医学对RS发生发展的新认识，以“伏邪多与痰瘀相关”为突破口，提出“痰瘀互结，毒损心络可能是PTCA术后再狭窄主要机制”假说。治疗应以“豁痰解毒，化瘀通络”为治疗原则。探讨豁痰解毒通络饮干预RS后内膜增生的作用机制，从而达到防治血管再狭窄目的。因此，我们确立以“痰瘀互结，毒损心络”为切入点，以豁痰解毒，化瘀通络为治疗原则，探讨中药复方通过干预炎症反应防治RS的作用机制。对明确了解中医药干预RS其作用机制奠定了理论基础。

参考文献

[1] Williams DO，Holvbkov R，Yeh W，et al.Percutaneous coronary intervention in the current era compared with 1985-1986 the National Heart，Lung，and Blood Institute Registries[J].Circulation，2000，102（24）：2945-2951.

[2] Rensing BJ，Harmans WR，Decker JWL.Uminal renarrowing after percutaneous translu minal coronary angloplasty followinggaussian distributin.A quantitative anglographic study in 1445 successfully delated lesions[J].Am J Cardiol.1992，19（6）： 939-945.

[3] Suc I，EscargeuilBlanc I，Truly Met a1.HDL and apoA prevent cell death of endothelial cells induced by oxidized LDL[J].Arterloscler ThrombVasc Biol，1997，17（8）：2158-2166.

[4] Cassells W， Engler D， wllenson j，et a1.Mechanism of restenosis[J].Tex Heart Last ，1994，21（8）：68-77.

[5] New G，Moses JW，Roub in GS， et a1.Estrogenaeluting， phosphory choline-coated stent implantation is associated with reduced neointimal form ation but no delay in vascular repair in a porcine coronary model[J].Catheter Cardiovasc Interv，2002，57（5）：266-271.

[6] 魯明源.冠心病化痰浊饮治法溯源与述评[J].山东中医药大学学报，2007，31（2）：31-33.

[7] 雷 燕，黄启福，王永炎.论疲毒阻络是络病形成的病理基础[J].北京中医药大学学报，1999，2（2）：1-5.

[8] 程小曲.痰浊型冠心病与血脂，脂蛋白，载脂蛋白的关系及痰浊形成机理的讨论[J].新中医，994，（3）：7-10.

本文编辑：李 豆endprint