小分子重编程体细胞为神经细胞的研究进展

高艳 ，秦鑫，张文静，邓文斌, ，赵保明 ，刘倩蓉*

（1湖北文理学院医学院形态学部，2分子医学中心，襄阳 441053；3美国加州大学戴维斯分校生物化学与分子医药学部，加州萨克拉门托 95817）

体细胞或成体细胞正常情况下处于高度分化的稳定状态，但是体细胞的这种状态可以在一定条件下被打破成为多能干细胞或另一种细胞类型[1]。2006年，Yamanaka等人取得了重编程技术突破，成纤维细胞通过病毒载体引入四个关键“重新编程因子”Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（统称为OSKM），可形成胚胎干细胞（ESC）样细胞，即诱导多能干细胞（iPSCs）[2,3]。iPSCs能够分化成任何细胞类型，而没有胚胎干细胞所面临的伦理问题。iPSCs的发现是干细胞研究和再生医学的一个里程碑。Yamanaka的研究提出了一个重新引入适当的转录因子，可以改变体细胞的命运，并使其进入一个新的细胞基因程序的重编程理念。因此，强制表达谱系特异性转录因子可以转变体细胞（例如成纤维细胞）成另一谱系细胞，如心脏细胞[4]、神经细胞[5]、肝细胞[6]等。尽管如此，外源基因的遗传传递具有一定的安全问题，比如遗传基因突变和基因插入。

目前，靶向信号传导途径、表观遗传修饰和代谢过程的小分子已被广泛用于改善基于转录因子的重编程或转分化[7]。不仅如此，不同小分子的组合可以单独诱导重编程和转分化而不需要重新引入外源基因[7,8]。在此，我们重点关注小分子在重编程和转分化神经细胞中的应用。

1 小分子在iPSCs和神经细胞重编程过程中的作用机制

小分子是可以调节特定细胞通路的生物活性化合物，参与细胞信号转导、转录、代谢和改变表观遗传，调控细胞重编程过程。如果选择性的表观遗传调控可以用化学药品来实现的话，可以改变转录因子基因的状态及获得启动子（无活性至活跃阶段），那么将不需要该基因的异位表达来实现重编程[9]。下面讨论的是每个类别中主要用于重编程的小分子。

1.1 小分子通过调节信号转导促进重编程

多能干细胞的特点是具有高度自我更新能力和多能性[10,11]。许多信号通路参与维持自我更新和多能性。因此，使用小分子抑制或激活这些通路可能有助于重编程多能性。

1.1.1 抑制ROCK信号通路

Rho激酶（ROCK）的亚型有ROCK1和ROCK2，GTP结合蛋白Rho激活下游ROCK。 ROCKs信号通路介导各种重要的细胞功能如增殖、基因表达、运动性、细胞形状等，以及与已知调节重编程的其他信号转导途径对话。抑制ROCK增强重编程的iPSCs的存活率，从而提高多能性重编程效率[12]。另外，ROCK抑制剂thiazovivin与SB431542（TGF-β通路的抑制剂）和PD0325901共同使用时，可以通过调节细胞间的相互作用，促进多能性重新编程[13]。

1.1.2 激活Wnt信号通路

Wnt信号通路参与控制多能干细胞自我更新和多潜能性。TCF3是Wnt信号通路下游的转录抑制子，占领多能性相关基因的启动子区域并抑制其表达[14]。Wnt信号的激活可以磷酸化TCF3促进那些多能性的基因表达。GSK-3β抑制剂CHIR99021直接激活Wnt信号增强重编程因子的重编程效率[15]。CHIR99021甚至可以取代Sox2，在只存在两个重编程因子Oct4和Klf4的条件下诱导多能性重编程[15]。另一种GSK-3β抑制剂Kenpaullone替代Klf4可能增加重编程效率大约10%[16]。结果表明小分子可以代替外源基因的功能诱导重编程。

1.1.3 阻断MAPK / ERK信号通路

在适当的信号诱导下多能干细胞可以分化，抑制与分化相关的信号通路可以维持iPSCs的多能性。已知MAPK / ERK信号传导途径的激活促进ESC分化[17]。MEK1 / 2抑制剂PD0325901阻断MAPK /ERK信号传导可有效的提高小鼠神经祖细胞晚期阶段多能性重编程[18]

1.1.4 抑制TGFβ信号通路

强烈诱导间充质-上皮的转化（MET）是重编程过程的关键事件之一，表现在成纤维细胞丧失间质特征和获得上皮特征[19,20]。研究证明MET是在重新编程期间需要克服早期的一个关键障碍[19,20]。TGF-β途径诱导上皮-间质转化（EMT）[21]，抑制TGF-β途径可以增强多能性重新编程。TGF-β通路的抑制剂SB431542、A83-01和Repsox（或E-616452）已被用于增强iPSCs重编程或甚至在不同的条件下代替重编程因子[13]。

1.1.5 激活JAK-STAT信号通路

JAK-STAT是继Ras通路之后又一重要的细胞因子信号传导通路，对于ESC多能性维持也是必不可少的。白血病抑制因子（LIF）与其受体LIF-R结合复合物含有信号转导子gp130，导致磷酸化和激活相关的JAK酪氨酸激酶。磷酸化的JAK激活潜在的转录因子STAT3，维持了ESC自我更新[22]。JAKSTAT的激活使小鼠神经干细胞或成纤维细胞重编程为iPSCs的效率增加三到四倍[23]。

1.2 小分子通过调节表观遗传促进重编程

体细胞重编程需要克服发育过程中建立的表观遗传障碍。越来越多的证据表明，表观遗传障碍导致了iPSCs产生的低效率[24]。靶向表观遗传修饰的小分子已经被发现可以显著改善重编程。

1.2.1 DNA甲基化的调节

DNA甲基化通常与基因沉默有关[25]，在体细胞中，多能性基因的调控区域DNA甲基化高度富集，因此，多能性基因受到抑制。因此重新激活甲基化多能性基因对于完成重新编程是至关重要的。用DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂5-氮杂胞嘧啶（5-aza）和RG108DNA抑制DNA甲基化，可以激活沉默的多能性基因，促进重新编程[26]。低剂量5-aza抑制DNMTs，但是高剂量时，通过掺入DNA和RNA引起毒性[27]。另外一种DNMT抑制剂地西他滨（decitabin）也可以诱导人体皮肤角质细胞表达Oct4和OCT4调节子mir-145[28]。

1.2.2 组蛋白甲基化和乙酰化调节

组蛋白可以进行翻译后修饰，例如甲基化和乙酰化。组蛋白甲基化有助于基因激活或抑制，而组蛋白乙酰化通常与基因激活有关[29]。组蛋白甲基化和乙酰化的调节可有效改善重新编程。

在小鼠胚胎成纤维细胞的基因组中，广泛抑制组蛋白H3K9me2 / 3明显阻止基于OSKM的重新编程[30]。补充小分子维生素C增强了基于OSKM重编程小鼠和人类的成纤维细胞，可能通过增加表达几种H3K9去甲基化酶去甲基化H3K9me2 / 3抑制了组蛋白H3K9me2 / 3发挥作用[30]。另外，当重编程介质中加入CYT296时，减少H3K9me3并增加了基于OSKM的重编程效率为10倍[31]。BIX-01294是一种H3K9me3组蛋白甲基转移酶（HMT）G9a特异性的抑制剂，仅转导Oct4和Klf4可重新编程小鼠胚胎成纤维细胞成iPSCs，提示BIX-01294可能取代Sox2[32]。H3K27me3也可以抑制重编程，使用维生素C减少多潜能基因（如Zfp42、Ddx4和Nanog）启动子区域的H3K27me3，从而促进了它们在pre-iPSCs向iPSCs转变期间的表达[33]。 H3K79甲基化抑制重编程，EPZ004777是H3K79组蛋白甲基转移酶Dot1l的抑制剂，减少H3K79提高了重编程率约四倍[34]。

除了抑制组蛋白甲基转移酶之外，抑制组蛋白去甲基化酶也可促进重编程。H3K4甲基化往往与基因激活有关。Tranylcypromine（或Parnate）是一种赖氨酸特异性脱甲基酶1（LSD1）抑制剂，去甲基化H3K4的甲基，增加了OSK或Oct4介导的从小鼠成纤维细胞产生iPSC（约20倍）[35]，或OK介导的人角质形成细胞产生iPSC[15]。可能与Tranylcypromine介导的抑制LSD1促进外源性OSK基因的表达和代谢开关有关[36]。小分子维生素C可以与H3K36me2/3去甲基酶Jhdm1a/1b协同作用，调控H3K36甲基化水平，促进细胞增殖，抑制细胞衰老，从而促进体细胞重编程[37]。

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是去除来自组蛋白的赖氨酸和其他调节蛋白和结构蛋白乙酰基的酶，参与转录调节、细胞周期进程、细胞生存和分化，并在染色质重塑中发挥关键作用。而组蛋白乙酰化通常与基因激活相关。因此HDACs抑制剂可提高组蛋白乙酰化水平如丙戊酸（VPA）[32]、丁酸钠（NaB）[38]、曲古抑菌素A（TSA）[38]和辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）[39]等已被证明可以促进多能性重新编程，VPA是最广泛使用的用于重新编程的HDAC抑制剂。

1.3 小分子通过调节代谢促进重编程

许多干细胞和高度增殖细胞与体细胞相比更依赖于有氧糖酵解以支持其增殖。例如，ESC自我更新与减少氧化磷酸化和增加糖酵解有关[40]。缺氧条件增强重编程效率支持这一点[41]。小分子强化氧化磷酸化向糖酵解的转变促进多能性重编程[1]

PS48是一种3＇磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1激活剂，可以提高代谢转化为糖酵解，增加Oct-4介导的重编程效率约15倍[42]。同样，许多促进糖酵解的小分子例如果糖2,6-二磷酸（磷酸果糖激酶1的激活剂）和槲皮素（增加HIF-1活性），更直接地提高重编程效率[42]。相反，糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖抑制了重编程过程[43]。

在重新编程的过程中，细胞的内容变化很大，细胞质的大分子和细胞器更新率高。发现自噬代谢通过降解那些蛋白质和细胞器来调节重新编程。小分子激活自噬使重编程效率增加了五倍，如雷帕霉素和PP242[44]。

2 小分子诱导体细胞再编程转化为神经细胞

2.1 小分子诱导产生神经干细胞或者神经前体细胞

在成人的大脑中，神经干细胞（NSCs）是神经元和神经胶质细胞的终生来源。 NSCs是能自我更新的多能细胞，外源刺激细胞外的微环境产生所有主要的中枢神经（CNS）细胞类型，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs被证实具有产生、修复和改变神经系统功能的可塑性[45]。2014年Cheng等人使用3种小分子鸡尾酒VPA（HDAC的抑制剂）、CHIR99021（一种GSK-3激酶的抑制剂）和Repsox（一种TGF-β途径的抑制剂），在生理缺氧条件下（5%O2），不引入外源性基因，可诱导来自MEF、小鼠尾尖成纤维细胞（TTF）和人类尿细胞（HUCs）产生神经前体细胞（ciNSC）[46]。这个过程主要伴随着激活内源性Sox2的表达。他们进一步研究发现可替代的小分子鸡尾酒“NLS”的组合（NaB，LiCl和SB431542））和“TLT”组合（TSA，Li2CO3和Tranilast），它们也可以在生理缺氧条件激活MEFs中内源性Sox2的表达。这些ciNSC在细胞特性和基因表达谱等方面与鼠脑源性NSCs相似，可以在体外和体内能分化成所有神经细胞类型。Zheng等报道了4种小分子将MEF转化为NSCs，这些小分子包括VPA，A83-01，Thiazovivin和Purmorphamine[47]。这两种组合中，GSK-3β抑制剂（CHIR99021）激活Wnt信号诱导神经干细胞，其作用可能会被Rho相关激酶（ROCK）抑制剂（Thiazovivin）和SHH途径活化（Purmorphamine）取代，这与Wnt信号传导和SHH信号传导促进NSC增殖有关[48]。此外，通过抑制ROCK保护细胞免于凋亡来增强神经细胞的活力[49]。 TGF-β抑制增强MET，VPA通过表观遗传调节提高重编程效率。

Zhang等用9种小分子和bFGF将MEFs转化为NSCs，其转换效率约为25%[50]。这些小分子包括LDN193189（Bmp I型受体ALK2 / 3的抑制剂），A83-01，CHIR99021，Hh-Ag 1.5（一种有效的Smo激动剂），视黄酸，RG108，Tranylcypromine，SMER28（自噬调节剂）[50]。Smo拮抗剂抑制SHH途径降低了诱导效率，提示激活SHH通路在神经诱导中的重要性。通过从组合中撤出单个分子，确定了BIX-01294、RG108和PD0325901对诱导发生很重要，虽然潜在的机制还不得而知。小分子组合（VPA，BIX-01294，RG108，PD0325901，CHIR99021，维生素C，A83-01）被发现诱导多达2%的MEF转化为NSCs[51]。

2.2 小分子诱导产生神经元

Pei等首次使用由七个小分子组合直接转化人类成纤维细胞为神经元[8]。他们使用VCRFSGY（VPA, CHIR99021，Repsox，Forskolin，SP600125，GO6983和Y-27632）组合诱导产生5%TUJ1阳性的人化学诱导神经元（hciNs）。“VCRFSGY”衍生的hciNs的电生理特性类似于iPSC衍生的神经元。VPA诱导表观遗传修饰，抑制TGF-β和GSK-3提高了用Ascl1和Ngn2因子进行稳定转导的人成纤维细胞的神经元转化[52]。Forskolin能够使神经元素2（neurogenin 2）有效地将人成纤维细胞转化为胆碱能神经元[53]。 SP600125可以促进OCT4重编程成人真皮成纤维细胞（AHDF）向神经细胞转化[42]。 Y-27632协助维持干细胞多能性和神经元存活[54]。因此，小分子组合VCRFSGY消除成纤维细胞特异性基因表达，特异性上调神经元基因表达并促进成人皮肤成纤维细胞（HAFs）向神经元转化。

Li等人直接使用四种分子（CHIR99021，Forskolin，ISX9，I-BET151）转换鼠成纤维细胞成神经细胞且aTUJ1阳性率高达90%[55]。 ISX9激活控制神经基因（Ngn2，NeuroD1，NF-H，Tau和Syn2），同时I-BET151抑制内源性成纤维细胞命运程序[55]。

除成纤维细胞外，其他体细胞也可以通过使用化学鸡尾酒编程的方法转化为神经元。 Cheng等人使用了VPA，CHIR99021和Repsox诱导使鼠星形胶质细胞转化成神经元（＞20%）[56]。Zhang等人设计了在8-10d内转换人类星形胶质细胞（约60%）成神经元的化学诱导方法[57]。他们筛选了九个小分子LDN193189, SB431542, TTNPB, Thiazovivin,CHIR99021, VPA, DAPT，Smoothened agonist（SAG）和Purmorphamine,抑制星形胶质细胞信号通路但激活神经元信号通路，逐步添加小分子诱导星形胶质细胞向神经元转化。为了分析每个单分子对于重新编程的贡献，他们从鸡尾酒中去掉每个分子，发现去除DAPT，CHIR99021，SB431542或LDN193189戏剧性减少星形胶质细胞向神经元转化。去掉VPA或SAG和Purmorphamine稍微降低了效率。去掉Thiazovivin或TTNPB没有显著影响星形胶质细胞向神经元转化。

另一个研究小组用六个小分子（VPA，CHIR99021，Repsox，Forskolin，I-BET151和ISX9）在12d内将人星形胶质细胞重编程为功能性神经元，转化效率为8%[58]。因为星形胶质细胞存在于大脑中，局部递送小分子能使星形胶质细胞向神经元的转换，可能导致星形胶质细胞原位直接转换成神经元，这是再生医学的最终目标。

2.3 小分子诱导产生星形胶质细胞

2013年Deng等人使用VC6TO 5个小分子鸡尾酒编程鼠胚胎成纤维细胞为星形胶质细胞（ciAs）[59]。这些化合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂VPA(V)、GSK3β的抑制剂CHIR99021（C）、TGFβ抑制剂616452（6）、赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶LSD1抑制剂tranylcypromine（T）和转录因子Oct4活化剂OAC1(O)[60]。他们又测试了其他TGFβ受体1的抑制剂A-83-01(A)和SB-431542（S），使用VCATO的组合或者VCSTO组合诱导MEFs发现具有星形胶质细胞形态和GFAP免疫反应阳性细胞的数量显著增加，而VCTO不能诱导出任何GFAP阳性的细胞。随后他们又用相同的方法诱导人成纤维细胞和小鼠尾尖成纤维细胞（TTFs）表达星形胶质细胞相关蛋白和基因且具有功能的星形胶质细胞[59]。结果提示了TGFβ抑制剂是将成纤维细胞转化为星形胶质细胞的关键。

3 小分子编程的应用及前景

病毒介导的转录因子通过诱导基因过度表达从而改变细胞的表观遗传特性，但是外源基因导入易引起临床安全问题。随着对重编程机制深入研究，筛选出许多小分子，不仅可以提高重编程效率还可以省略外源基因。完全使用小分子取代外源基因是一种有吸引力的细胞重编程方法。与病毒介导的转录因子基因诱导相比，小分子对细胞重编程易于合成、储存、滴定、优化、成本低、起效快且可逆，易操作、可以在局部发挥作用等优势。可以通过调控不同的组合和浓度改变编程效果。尽管小分子已经开始控制细胞命运，但是其基本机制及效果并不清楚。因为小分子往往有多个作用目标，他们的作用是非特异性的。另外，小分子之间存在有不同组合协同或拮抗作用。因此，解释使用每个分子的作用机制是很艰巨的任务。未来的研究应该进一步阐明小分子的机制，这将有助于优化组合、浓度和暴露时间确保临床应用安全。我们相信小分子的发展将会加速细胞重编程和转分化在临床的应用。

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