改良乙酰胆碱酯酶染色在快速病理诊断先天性巨结肠中的应用

董愉，杨诗聪，吴惠群，梁英杰

（中山大学附属第一医院病理科，广州 510080）

先天性巨结肠是小儿外科常见病, 发病率在小儿消化道先天性畸形中位居第2位[1]。临床诊断先天性巨结肠 ( Hirschsprung’s disease , HD)主要以病理诊断为依据，而手术中快速活体组织病理学检查对HD的正确诊断率不是很理想[2]。HD直肠黏膜固有层腺体之间有增生的胆碱能纤维，乙酰胆碱酯酶染色可以将这些增生的胆碱能纤维显示出来。因此，对直肠黏膜组织乙酰胆碱酯酶染色是HD病理诊断的主要检查方法。本文对乙酰胆碱酯酶组织化学染色方法进行探讨和改良，即将底物碘化乙酰硫代胆碱的浓度增加10倍，高浓度的底物加快渗透组织，缩短孵育染色时间, 使操作更加快速和简单，便于手术中HD的快速病理诊断，为手术治疗HD提供可靠的依据。

材料与方法

1 材料

临床送检直肠黏膜新鲜组织，OCT包埋剂包埋，用低温恒冷切片机进行冰冻切片，厚度为6～8μm。阳性对照为大鼠舌肌6～8μm的冰冻切片。

2 试剂

30% H2O2水溶液，4℃保存；底物储备液：先用1ml蒸馏水溶解碘化乙酰硫代胆碱50mg，然后依次加入0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH5.5）6ml，2.9%枸橼酸钠水溶液1ml，0.75%硫酸铜水溶液1ml，0.28%四异丙基焦磷酰胺0.1ml，混合后放-20℃保存；0.17%铁氰化钾水溶液，4℃保存；孵育液：底物储备液9ml加0.17%铁氰化钾水溶液1ml，使用前混合，37℃预热；DAB溶液：DAB和含H2O2的缓冲液，4℃保存，用前1∶100稀释。

3 染色方法

以传统的亚铁氰化铜法[3]为基础并进行改良：①将直肠黏膜冰冻切片和阳性对照片放入预热37℃的30% H2O2水溶液3min，蒸馏水稍洗；②入预热37℃的孵育液孵育10～15min，蒸馏水稍洗；③滴加DAB溶液0.5min, DAB与孵育后形成的反应物结合,使反应产物颜色更深, 更稳定而不容易褪色。蒸馏水稍洗；④Mayer’s苏木精液复染细胞核0.5min，蒸馏水稍洗；⑤促蓝液返蓝0.1min，蒸馏水稍洗；⑥常规脱水透明，中性树胶封片。另一组相同组织的连续切片按传统的亚铁氰化铜法进行染色。

结 果

1 改良法与传统方法主要实验步骤及时间的比较

与传统方法比较，改良法多了H2O2处理的步骤，但孵育时间从60～120min缩短至10～15min，大大缩短了整个染色操作时间（表1）

2 改良法与传统方法检测结果的比较

表1 改良法与传统方法主要实验步骤及时间的比较Tab.1 Comparison of modified and conventional Karnovsky Roots methods on the main experimental procedure and time

先天性巨结肠症的直肠黏膜固有层腺体之间可见增生的胆碱能纤维，乙酰胆碱酯酶阳性呈棕黑色；对照组织大鼠舌肌上的运动终板乙酰胆碱酯酶阳性，为棕黑色椭圆形或扁平小圆。正常直肠黏膜固有层腺体之间没有增生的胆碱能纤维，乙酰胆碱酯酶染色为阴性。本改良法与传统的亚铁氰化铜法相比较染色特异性无明显差异，传统染色方法乙酰胆碱酯酶阳性呈棕色至深棕色（图1）。

讨 论

乙酰胆碱酯酶存在于胆碱能神经纤维，因此，乙酰胆碱酯酶组织化学染色是显示胆碱能神经纤维常用而可靠的方法。手术中直肠组织冰冻切片HE染色常常难以诊断先天性巨结肠，但通过乙酰胆碱酯酶染色，在冰冻切片直肠黏膜的固有层中显示出增生的胆碱能神经纤维即可作出诊断。Nakao 等学者对91例新生儿中乙酰胆碱酯酶染色诊断HD进行评价,特异性为100% ,敏感性为91%[4]。

乙酰胆碱酯酶组织化学染色常用的方法是亚铁氰化铜法。传统的亚铁氰化铜染色方法，配制孵育液染色所需的各种试剂在4℃冰箱保存，染色前需要称取底物，溶解底物后再将各种试剂依次混合配成孵育液，孵育液在配制和从4℃预热到37℃都需要一定的时间。为了达到快速染色的目的，改良的方法是先分别配制好底物储备液和铁氰化钾水溶液低温保存，标本送检前即可以将一次染色用量的底物储备液和铁氰化钾水溶液分别在37℃恒温箱预热，染色前两种试剂混合即马上可以孵育组织切片。由于底物碘化乙酰硫代胆碱对组织的渗透性较差，传统方法孵育液孵育组织切片时间较长，为60～120min。改良法将底物碘化乙酰硫代胆碱的浓度增加10倍，高浓度的底物可以加快渗透组织，孵育染色时间从60～ 120min缩短至10～15min。配制孵育液前先分别配制底物储备液和铁氰化钾水溶液，是避免铜离子和铁氰化钾起反应形成沉淀物，降低铜离子的浓度而影响染色。

图1.乙酰胆碱酯酶染色改良法与传统法的比较。A，传统法染色，先天性巨结肠症；B，改良法染色，先天性巨结肠症；C，改良法染色，阴性对照； D，改良法染色,阳性对照，箭，乙酰胆碱酯酶阳性；比例尺，50μmFig.1 Comparison of Modified method and conventional method on acetylcholinesterase histochemical staining.A, staining of Hirschsprung’s disease tissue using conventional method; B, staining of Hirschsprung’s disease tissue using modified method; C,modified method staining of negative control tissue; D, modified method staining of positive control tissue.Arrows pointed to acetylcholinesterase positive stain; scale bar, 50µm

乙酰胆碱酯酶阳性显色是染色过程中，组织化学反应最终形成棕色的亚铁氰化铜沉淀，但亚铁氰化铜沉淀并非绝对不溶[5]。因此在孵育染色后用DAB（二氨基联苯胺）处理, 目的是使阳性产物更加稳定，颜色由棕色加深为棕黑色，不容易退色，更易于观察。DAB为致癌物[6]，应避免接触皮肤。孵育前都要用H2O2水溶液封闭组织细胞内的内源性过氧化物酶，防止非特异性染色。实际上内源性过氧化物酶对观察胆碱能神经纤维的干扰很少，在操作过程中可以省去H2O2水溶液封闭这一步，节省操作时间。

在乙酰胆碱酯酶染色过程中，醋酸盐缓冲液pH的变化，各种试剂配制和保存是否得当等多种因素都可以影响染色的结果。因此，每次染色都应该设有阳性和阴性对照片，防止假阳性和假阴性。乙酰胆碱酯酶主要存在于神经与肌肉接头处[7]，因此常用大鼠舌肌组织作为阳性对照，用正常或非HD的直肠黏膜冰冻切片作阴性对照。可预先切取多张冰冻切片对照片放在-20℃冰箱保存。

经常规甲醛固定、脱水，石蜡包埋的组织，其中乙酰胆碱酯酶的活性全部消失，因此乙酰胆碱酯酶染色只能用新鲜组织的冰冻切片。直肠黏膜在取材切片时，应对直肠黏膜进行竖立包埋，切取黏膜腺体的横切面，这样可以更好地观察在直肠黏膜固有层腺体之间乙酰胆碱酯酶阳性的神经纤维。应用免疫组化技术也能进行先天性巨结肠症的病理诊断[8-10],但免疫组化染色需要1h以上，耗时长。

本改良法使乙酰胆碱酯酶染色操作更加快速和简单，结果稳定可靠，提供更快的手术中HD的病理诊断，对临床医生制定HD的治疗方案具有十分重要的意义。

[1]王果，李振东.小儿肛肠外科学.郑州：中原农民出版社，1999：469-470.

[2]Maia DM.The reliability of frozen section diagnosis in the pathologic evaluation of Hirschsprung’s disease.Am J Surg,2000, 24 (12)∶ 1675-1677.

[3]梁英杰，凌启波，张威.临床病理学技术.北京：人民卫生出版社，2011：257.

[4]Nakao M, Suita S, Taguchi T, et al.Fourteen-year experience of acetylcholinesterase staining for rectal mucosal biopsy in neonatal Hirschsprung’s disease.J Pediatr Surg, 2001, 36∶1357-1363.

[5]陈啸梅，周文郁，彭俊云，等.组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982：133.

[6]陈红杏，封苏平，黄兰仙，等.病理科职业安全隐患分析与对策.中国公共卫生管理，2013，29（5）：663.

[7]凌启波.实用病理特殊染色和组化技术.广东：广东高等教育出版社，1989：289.

[8]殷敏智，张忠德，沈萍.免疫组织化学方法在先天性巨结肠诊断中的应用.实用儿科临床杂志，2005，20（11）：1159.

[9]刘虎，徐兵.新生儿巨结肠诊断的现状与进展.医学综述，2010，16（16）：2434.

[10]朱伟雄，李雪清，严丽霞.神经标记物在先天性巨结肠中的表达.实用医学杂志，2014，30（13）：2316.