马铃薯Y病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

王玉+黄显德+魏代福+温亮+杨举田+陈秀斋+田延平

摘要：采用RT-PCR方法扩增马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）衣壳蛋白（coat protein，CP）基因，将其连接到原核表达载体pEHISTEV上，获得重组质粒pEHISTEV-PVY-CP，转化大肠杆菌Rosetta，经 IPTG诱导后，可以表达出分子量为35 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白，免疫新西兰大耳兔制备PVY CP抗血清。间接ELISA结果表明，该抗血清的效价为1∶16384，Western blot分析表明该抗血清只与感染PVY的普通烟植株有特异性反应，而与健康普通烟和感染PVX的普通烟植株无反应。本研究为PVY的血清学检测以及早期预警奠定了基础。

关键词：马铃薯Y病毒；衣壳蛋白；原核表达；抗血清制备

中图分类号：S532：Q786 文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0111-04

Abstract The coat protein （CP） gene of Potato virus Y （PVY） was amplified by RT-PCR and was cloned into prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PVY-CP， which was transformed into competent cells of Escherichia coli strain Rosetta， and a 35 kD fusion protein was expressed after induced by IPTG. The fusion protein was cut from the gel and used as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against the PVY CP. The titer of the resultant antiserum was 1∶16384 in ELISA. In Western blot assay， the antiserum showed specific positive reaction only with Nicotiana tabacum plants infected with PVY， but not with healthy Nicotiana tabacum plants or those infected with Potato virus X. The results laid bases for serological test and early warning work of PVY.

Keywords Potato virus Y； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum preparation

馬铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是危害马铃薯、烟草等茄科植物的主要病毒之一。PVY侵染马铃薯可引起叶脉坏死、褐脉、黄斑坏死等症状，导致马铃薯减产80%以上[1-3] ，对生产造成严重的损失；PVY侵染烟草后可造成烟叶产量损失达20%～50%，严重时可造成绝收[4，5]。PVY自1931年首次在马铃薯中发现以来，已在全球广泛传播[6]。20世纪 90 年代初， PVY 在中国及亚洲地区周边国家呈上升发展趋势，目前该病毒在世界各地均有发生[7-10]。

马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），主要由蚜虫以非持久方式传播。病毒粒体为弯曲线状，无包膜，大小约11 nm×700～900 nm，基因组为长约10 kb的正单链RNA，通过多聚蛋白策略编码1个多聚蛋白，经蛋白酶切割后形成10个蛋白，PVY 基因组内还有一个由移码翻译产生的PIPO蛋白，通过这两种方式最后形成11个成熟的多功能蛋白[11-14]。

目前，血清学方法由于具有操作简单、特异性强、灵敏度较高等特点而被广泛应用于病毒病的快速检测。本试验，我们选用质粒 pEHISTEV构建PVY CP的原核表达载体并在大肠杆菌中高效表达，通过免疫新西兰大耳兔制备相应的特异性抗血清，以期为 PVY检测和预警奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株Escherichia coli DH5α、Rosetta （DE3）由本实验室保存，原核表达载体pEHISTEV由英国安德鲁斯大学刘焕庭老师惠赠；反转录酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、无RNA酶的水等均购自TaKaRa公司；植物总RNA提取试剂盒TRIzol、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京全式金公司；硝酸纤维素膜为 PallGelman 公司产品；碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG、弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自Sigma 公司；Western blot 所用蛋白Marker 购自Thermo公司；IPTG、DTT、KCl 等试剂为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 原核表达载体的构建 根据PVY-N605（GenBank序列号：X97895）基因组序列设计引物扩增PVY CP基因。正向引物为PVY-CP-NcoⅠ-F：5′-CAT GCC ATG GCT TGG AAT GCA ACA ATC GAT GCA G-3′，下划线部分为NcoⅠ酶切位点；反向引物为PVY-CP-BamHⅠ-R：5′-CGC GGA TCC TTA CAT GTT CTT CAC TCC AAG TAG AGT ATG C-3′，下划线部分为BamHⅠ酶切位点。以本实验室采集的感染PVY的普通烟叶片为材料，参照TransZol 试剂盒说明书提取叶片总RNA。以总RNA 为模板，在随机引物的引导下利用反转录试剂盒合成第一链 cDNA。利用引物PVY-CP-NcoⅠ-F和PVY-CP-BamHⅠ-R，以cDNA为模板进行PCR，扩增CP基因。PCR反应程序：98℃预变性30 s；98℃ 10 s，64.8℃ 20 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。endprint

将目的片段和pEHISTEV分别用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，利用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送济南博尚公司测序验证。序列正确的重组质粒命名为pEHISTEV-PVY-CP。

1.2.2 目的基因的诱导表达 将pEHISTEV-PVY-CP转化大肠杆菌Rosetta，涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB平板上。挑取单菌落接种到含50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。取1 mL培养液稀释于100 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150 r/min培养至OD600≈0.6。IPTG终浓度设0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 5个处理，于28℃、150 r/min诱导4 h。取诱导菌液1 mL，12 000 r/min离心2 min，加适量TE缓冲液（pH值8.0）振荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min后进行SDS-PAGE电泳。通过比较蛋白表达量，筛选最佳IPTG浓度。诱导时间设1、2、3、4、5 h和6 h共6个处理，在最佳IPTG浓度下，筛选最适诱导时间。

1.2.3 抗血清的制备、效价及特异性的测定 通过SDS-PAGE电泳对原核表达产物进行分离，用冰冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取乳白色目的条带，加入适量0.9%生理盐水在灭菌的研钵中研磨。采用皮下多点注射的方法免疫新西兰大耳兔，初次免疫用等体积的弗氏完全佐剂乳化，之后改用弗氏不完全佐剂。每隔一周免疫一次，免疫剂量为3 mL，共免疫4次。第四次免疫后一周取血，通过离心分离血清。

取PVY接种的普通烟叶片，按1∶10（W/V）抗原包被缓冲液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6），充分研磨后8 000～10 000 r/min离心2 min，取上清包被酶联板，每孔100 μL。以用同样的方法处理的健康普通烟叶片作为阴性对照，以0.05 mol/L碳酸盐缓冲液为空白对照。抗血清按照1∶26～1∶215进行梯度稀释。利用ELISA法测定抗血清效价。显色后使用酶标仪读取405 nm的OD值，I（待测样品读数-空白读数）/ H（阴性样品讀数-空白读数）≥3为阳性反应。

以感染PVY的普通烟叶片为检测对象，健康普通烟叶片为阴性对照，同时以感染马铃薯X病毒（PVX）的普通烟叶片为对照，参照Towbin等[11]的方法进行Western blot，分析抗血清的特异性。

2 结果与分析

2.1 PVY CP基因的克隆

利用引物PVY-CP-NcoⅠ-F和PVY-CP-BamHⅠ-R通过PCR扩增得到825 bp的CP基因。纯化回收后用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，克隆到同样酶切处理的pEHISTEV载体中，获得重组质粒pEHISTEV-PVY-CP。通过PCR扩增和测序证明其开放阅读框正确。

2.2 PVY CP诱导表达和SDS-PAGE分析

将pEHISTEV-PVY-CP转化大肠杆菌Rosetta，菌液经不同浓度IPTG和时间诱导后，进行SDS-PAGE分析。结果表明，与未诱导菌液相比，包含pEHISTEV-PVY-CP的Rosetta菌液在不同的IPTG浓度及时间段下均表达出约35 kD的蛋白条带（图1、2），与预期大小一致，说明PVY CP在大肠杆菌中得到了正确表达。在IPTG终浓度为0.2～1.0 mmol/L时，随着IPTG浓度的增加，PVY CP表达量无显著差异（图1），我们选择IPTG终浓度为0.2 mmol/L。在IPTG终浓度为0.2 mmol/L、诱导时间为1～6 h情况下，随着诱导时间的增长，目的蛋白的表达量增加（图2），我们将诱导时间定为6 h。

2.3 抗血清效价

从SDS-PAGE凝胶中切下目的蛋白条带，经乳化后免疫新西兰大耳兔，获得PVY CP 抗血清。以感染PVY的普通烟叶片为材料，以健康普通烟叶片为阴性对照，利用ELISA测定抗血清效价。结果表明，当病汁液稀释10倍，抗血清稀释16 384倍时仍呈现明显的阳性反应，而稀释32 768倍时检测结果为阴性，说明抗血清的效价为1∶16384（表1）。

2.4 抗血清特异性检测

Western blot结果显示，所制备的PVY CP抗血清仅与感染PVY的普通烟样品发生特异性反应，而与健康普通烟叶片或感染PVX的普通烟样品均无反应（图3），说明制备的血清有良好的特异性M：蛋白分子质量标准；1：PVY侵染的普通烟叶片；2：PVX侵染的普通烟叶片；3：健康的普通烟叶片。

3 讨论与结论

马铃薯Y病毒是危害马铃薯和烟草的主要病毒之一。除单独侵染外，在自然环境中PVY还常与烟草蚀纹病毒（TEV）、烟草脉带花叶病毒（TVBMV）、马铃薯X病毒（PVX）等复合侵染[15-17]。与TMV和PVX相比，PVY在植株内的积累水平较低，不易获得大量提纯病毒，且利用常规方法提取植物病毒时不能完全排除寄主蛋白，用这样的病毒制剂制备的血清容易产生假阳性。本研究利用大肠杆菌表达的PVY CP制备了抗血清，该抗血清效价为1∶16384，只与PVY有特异性反应，与健康植株和PVX无反应，并且与寄主蛋白也无反应，说明获得的抗血清效价高、特异性好，为PVY的快速检测和早期预警奠定了良好的基础。

参 考 文 献：

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