磷脂酶Cβ1上调表达与肝细胞肝癌增殖和预后相关

褚 亚， 周 石， 王黎洲， 安天志， 蒋天鹏， 宋 杰， 李 兴

肝细胞肝癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率呈逐年增长趋势［1-3］。近期研究发现癌基因与癌基因激活途径对肝癌发生、发展有重要作用［4］。 磷脂酶 Cβ1（PLCβ1）由位于染色体20p12的PLCβ1基因编码而成，作为最初G蛋白偶联受体与PLCβ异构体偶联，催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）形成 1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）、二酰甘油（DAG）［5］并在细胞信号转导中起重要作用，该通路调节异常往往加快肿瘤发展［6］。Gα蛋白激活PLCβ1导致细胞内钙离子增加，最终引起细胞异常增殖［7］。PLCβ1参与多种疾病发展过程，精神分裂症患者大脑中能检测其异常表达［8］。小鼠PLCβ1基因剔除后表现出与精神分裂症相关认知行为［9］。作为成肌细胞分化关键调节因子，PLCβ1对强直性肌营养不良的骨骼肌分化有促进作用［10］。PLCβ1能减少细胞氧化应激损伤和防止α-突触核蛋白聚集［11］，表明扩增其基因能促进K562细胞生长和防止细胞凋亡［12-13］。 此外，PLCβ1阳性靶向细胞周期蛋白 D3并通过蛋白激酶Cα介导途径调节细胞周期和细胞增殖［14］。 PLCβ1过表达使 Swiss 3T3细胞进入细胞周期 S 期［15］。致癌过程中 PLCβ1 水平也有所提高［16］。Molinari等［17］证实乳腺癌中 PLCβ1基因拷贝数发生改变，乳腺癌组织学分级和增殖指数与PLCβ1过表达有关。为了解PLCβ1对HCC细胞增殖及预后的影响，本研究探讨PLCβ1表达能否促进HCC细胞生长和迁移，删除或抑制PLCβ1能否延缓其增殖，从而为预防和治疗HCC提供新靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

HEK293T细胞，LO2人肝细胞株，人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、LM3、Huh7、H7402（美国菌种保藏中心ATCC），均置入含10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，美国Gibco公司），并置于含5%CO2、37℃95%空气加湿孵化器中培养。

1.2 免疫组织化学染色检测

本研究经医院伦理委员会审查通过，肝癌标本由医院病理科提供，均经病理证实为HCC。采用组织芯片（tissuemicroarrays，TMA）技术，分别将芯片载入 51 例（TMA1）、90 例（TMA2）HCC 患者肿瘤及癌旁组织（上海芯超生物科技公司），二甲苯脱蜡与乙醇脱水复水，于柠檬酸和内源性过氧化物酶缓冲液中作抗原回收，再用10%山羊血清清洗，减少TMA非特异性染色；4℃下孵育抗 PLCβ1抗体（1∶200，sc-205，美国Santa Cruz生物技术公司）；磷酸缓冲液（PBS）洗涤后，用辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗30min，再次PBS洗涤；用二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精-伊红（HE）复染。采用半定量评分系统评价染色片强度（0、1、2、3）和阳性百分比，两分数相乘计算最终得分，分为低表达组和高表达组。

1.3 实时定量聚合酶链反应检测

采用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）分离细胞总RNA，PrimeScriptTM逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（日本 TaKaRa公司）合成 cDNA第 1链，SYBR Green染色7500序列（美国ABI公司）检测PLCβ1 mRNA表达水平，β-肌动蛋白作为内部对照。人PLCβ1基因扩增引物：正向引物为5’-GATGAGCCCAGATGGCCG-3’， 反向引物为 5’-AGTTGAGTCATCATCCCACTTGA-3’。 β-肌动蛋白引物：正向引物为5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’， 反向引物为 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.4 蛋白印迹检测

采用抗磷酸化细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2（4376#）、抗 ERK1/2（9102#）（美国 CST 公司）、抗-双特异性磷酸酶（DUSP）1（sc-370）、抗 β-肌动蛋白（sc-47778）（美国 Santa Cruz生物技术公司）检测PLCβ1印迹。将细胞置于含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液（美国Sigma公司）裂解，二辛可酸（BCA）法测定总蛋白浓度，将60μg总蛋白于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）下分离，分离蛋白移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司）并用无脂牛奶封膜，一抗孵育过夜；Tris缓冲0.9%NaCl液（TBST）洗涤后，将膜与HRP标记的二抗一起孵育，增强型化学发光（ECL）显色。

1.5 PLCβ1过表达构建与RNAi介导PLCβ1敲除

慢病毒载体pLK0.1-TRC克隆PLCβ1 cDNA。psPAX2和pMD2G质粒构建重组慢病毒细胞系，以便稳定地过表达PLCβ1；shRNA有限扰码序列编码PLCβ1作为对照组。

1.6 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7活性检测

将细胞接种至96孔板（2×103细胞/孔）。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，日本Dojindo公司）分别于24、48、72、96 h 评估细胞活力，450 nm 处测定其吸光度。72 h时清除血清，检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3/7活性。实验至少重复3次。

1.7 集落形成检测

将细胞接种至 6孔板（2×104细胞/孔）并培养10 d，指定时间点用PBS洗涤细胞2次，结晶紫处理10min后洗涤，然后计数、检测。实验至少重复3次。

1.8 肿瘤治疗

141例HCC患者均接受外科手术切除，术后常规每 1、3、6、12 个月门诊随访甲胎蛋白（AFP），腹部增强CT和/或MRI；12个月后每半年随访1次。若患者影像学表现提示肿瘤复发和/或AFP增高，则每隔1～3个月予介入灌注化疗栓塞及射频消融等综合治疗。

1.9 数据分析

采用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 5软件进行统计血分析和图形显示。计量资料以均数±标准差（±s）表示，卡方检验分析临床特征与PLCβ1表达的关系，t检验评估体外研究，Kaplan-Meier法评估总生存期（OS），单因素和多因素风险比分析用Cox回归模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLCβ1表达与HCC预后关系

免疫组织化学染色检测显示，TMA1、TMA2细胞核和细胞质中检测到PLCβ1蛋白，结果发现HCC组织中PLCβ1表达比癌旁组织明显增高（图1）。141例HCC标本中80例标本检测显示PLCβ1呈高表达，PLCβ1表达与巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期密切相关（P＝0.014 5），与其它参数和特征无显著相关（表1）；Kaplan-MeierK曲线与OS分析显示，PLCβ1高表达患者比低表达患者生存率低，平均生存时间明显缩短（P＝0.001）（图 2），表明 PLCβ1 表达与OS显著相关；Cox回归单因素分析显示OS与肿瘤大小、BCLC分期、PLCβ1表达有关，多因素分析表明PLCβ1显著表达是与HCC患者OS明显相关的独立预后因素（表2）。

2.2 PLCB1对HCC细胞增殖和凋亡的影响

图1 PLCβ1在HCC组织中过表达

表1 PLCβ1表达与HCC患者临床参数相关性 n

图2 141例HCC患者Kaplan-Meier分析

表2 Cox回归分析141例HCC患者OS结果

RT-PCR和蛋白印迹检测结果表明，人肝癌细胞系中PLCβ1对应mRNA和蛋白（图3）水平表达均比LO2人肝细胞系高。蛋白印迹检测证实慢病毒载体构建了稳定过表达PLCβ1的HepG2和Huh7细胞（图4①），CCK-8检测结果表明PLCβ1过表达的HepG2和Huh7细胞活力比对照细胞明显增高（图4②），集落形成检测和结晶紫染色显示PLCβ1过表达细胞生长能力比对照细胞增强（图4③），细胞凋亡检测发现PLCβ1过表达细胞caspase-3/7活性显著降低（图4④）；表明PLCβ1过度表达可促进PLCβ1细胞生长并抑制其凋亡。慢病毒递送shRNA（SH-1和SH-2）降低PLCβ1内源性表达实验显示，Hep3B和LM3细胞shRNA表达PLCβ1比SH-1和SH-2增强（图5①），体外细胞存活率和集落形成检测显示PLCβ1低表达的SH-1和SH-2细胞增殖抑制明显（图5②③），SH-1和SH-2细胞caspase-3/7活性比对照（shCON）细胞增高（图5④）；表明下调PLCβ1能抑制PLCβ1细胞恶性表达。

2.3 PLCβ1致癌性与ERK活化关系

蛋白印迹检测ERK激活状态表明，PLCβ1高表达的HepG2和Huh7细胞显著刺激ERK1/2细胞转导通路磷酸化，而降低PLCβ1表达的Hep3B细胞有效下调ERK1/2通路磷酸化水平（图6①②），集落形成检测显示ERK抑制剂U0126可抑制PLCβ1对HCC细胞生长的促进作用（图6③），DUSP1表达均无明显变化；表明PLCβ1可调节激活HCC细胞ERK信号转导通路，从而促进致癌活性。

3 讨论

癌基因激活与关键转导通路异常激活通常是非肿瘤细胞瘤变必不可少的环节［18-19］。本研究表明，PLCβ1过表达能促进细胞生长，反之抑制生长；ERK信号通路异常激活可能与PLCβ1有关；PLCβ1表达升高可能与HCC进展呈正相关。因此，PLCβ1可能作为一种新的HCC独立预后因素。

图3 PLCβ1在LO2人肝细胞系和人肝癌细胞系中表达

图4 PLCβ1过表达对HepG2和Huh7细胞增殖和凋亡的影响

图5 PLCβ1低表达对Hep3B和LM3细胞增殖和凋亡的影响

图6 ERK对PLCβ1致癌活性的影响

细胞外信息传递可刺激细胞内部转导通路激活。PLCβ1可编码磷脂酰肌醇特异酶，激活G蛋白并催化其形成第2信使，启动进一步细胞内信号转导［20］。有研究表明PLCβ1在调节疾病各种功能方面起重要作用［11-21］。小鼠模型中PLCβ1低表达可能诱发癫痫［7］。 Hela 细胞中 PLCβ1 参与 IP3 生成［22］。 乳腺癌组织学分级和增殖指数与PLCβ1密切相关，PLCβ1 低表达患者预后相对较好［17］。

既往研究发现，位于染色体8q和20的某个基因可作为肝母细胞瘤预后不良的预测因素［23］。PLCβ1基因位于染色体20p12，其上调情况受到关注。但迄今尚未见PLCβ1表达与HCC间关联相关报道。本研究结果表明PLCβ1与肝癌BCLC分期有相关性，与肿瘤大小、是否伴发肝硬化等无明显相关，但肿瘤发生涉及复杂机制；PLCβ1可能作为一种生物标志物，明确HCC表型；PLCβ1高表达患者表现出较低OS。多因素分析表明PLCβ1表达是HCC独立预后因素。

PLCβ1促进肝癌进展机制尚不明确。本研究体外实验表明PLCβ1过表达促进肝癌细胞增殖并抑制其凋亡，并激活已证明能影响细胞生长和凋亡的ERK信号转导通路。ERK激活是通过调节DUSP去磷酸化实现的［24］。PLCβ1改变引起DUSP1表达变化，提示ERK激活。此外，胰岛素样生长因子（IGF）-Ⅰ可能引起细胞核ERK活化，同时诱导细胞核PLCβ1磷酸化，启动磷酸肌醇循环［25］，这可能是PLCβ1与ERK信号通路之间调节环路。近年抑制ERK激酶活性化合物研究已取得部分前期临床结果，在癌症治疗中取得一些进展［26］。本研究发现PLCβ1过表达介导的部分细胞增殖效应，可被ERK抑制剂阻断。

总之，本研究由肝癌发生发展中的临床标本和体外实验结果验证，HCC患者PLCβ1过表达可能在促进肿瘤发生中起重要作用，且与侵袭性行为密切相关，可作为HCC预后的一个预测指标；抑制PLCβ1介导的信号通路可能会控制HCC进展，PLCβ1可能是今后肝癌治疗的潜在分子靶点。

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